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टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी है जो संक्रमित मेजबान के सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है और इसे मस्तिष्क ट्यूमर के विकास की घटनाओं से जुड़ा हुआ माना जाता है।इस अध्ययन में, हम अनुमान लगाते हैं कि टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण से एक्सोसोमल miRNA-21 मस्तिष्क ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देता है।टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी2 माइक्रोग्लिया से एक्सोसोम की विशेषता बताई गई और यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के आंतरिककरण की पुष्टि की गई।एक्सोसोमल माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण टोक्सोप्लाज्मा गोंडी और ट्यूमर सॉर्टिंग से जुड़े माइक्रोआरएनए और माइक्रोआरएनए-21ए-5पी के सरणियों का उपयोग करके किया गया था।हमने एक्सोसोम में miR-21 के स्तर को बदलकर और मानव U87 ग्लियोमा सेल प्रसार पर एक्सोसोम के प्रभाव द्वारा U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में ट्यूमर से जुड़े जीन के mRNA स्तर की भी जांच की।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी से संक्रमित यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के एक्सोसोम में, माइक्रोआरएनए-21 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और एंटीट्यूमर जीन (फॉक्सओ1, पीटीईएन, और पीडीसीडी4) की गतिविधि कम हो जाती है।टोक्सोप्लाज्मा से संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करते हैं।एक्सोसोम एक माउस ट्यूमर मॉडल में U87 कोशिकाओं के विकास को प्रेरित करते हैं।हमारा सुझाव है कि टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी2 माइक्रोग्लिया में बढ़ा हुआ एक्सोसोमल एमआईआर-21 एंटीट्यूमर जीन को डाउनरेगुलेट करके यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं में सेल ग्रोथ प्रमोटर के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
यह अनुमान लगाया गया है कि 2018 में दुनिया भर में उन्नत कैंसर के 18.1 मिलियन से अधिक मामलों का निदान किया गया था, जिसमें हर साल लगभग 297,000 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ट्यूमर का निदान किया गया था (सभी ट्यूमर का 1.6%)1।पिछले शोध से पता चला है कि मानव मस्तिष्क ट्यूमर के विकास के जोखिम कारकों में विभिन्न रासायनिक उत्पाद, पारिवारिक इतिहास और सिर के चिकित्सीय और नैदानिक ​​उपकरणों से आयनीकृत विकिरण शामिल हैं।हालाँकि, इन विकृतियों का सटीक कारण अज्ञात है।दुनिया भर में लगभग 20% कैंसर संक्रामक एजेंटों के कारण होते हैं, जिनमें वायरस, बैक्टीरिया और परजीवी3,4 शामिल हैं।संक्रामक रोगज़नक़ मेजबान कोशिका के आनुवंशिक तंत्र, जैसे डीएनए की मरम्मत और कोशिका चक्र को बाधित करते हैं, और पुरानी सूजन और प्रतिरक्षा प्रणाली को नुकसान पहुंचा सकते हैं।
मानव कैंसर से जुड़े संक्रामक एजेंट सबसे आम वायरल रोगजनक हैं, जिनमें मानव पेपिलोमावायरस और हेपेटाइटिस बी और सी वायरस शामिल हैं।परजीवी मानव कैंसर के विकास में भी संभावित भूमिका निभा सकते हैं।कई परजीवी प्रजातियाँ, जैसे कि शिस्टोसोमा, ओपिशोरचिस विवरिनी, ओ. फेलिनस, क्लोनोरचिस साइनेंसिस और हाइमेनोलेपिस नाना, को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर 6,7,8 में शामिल किया गया है।
टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ है जो संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है।अनुमान है कि यह परजीवी दुनिया की लगभग 30% आबादी को संक्रमित करता है, जिससे पूरी आबादी खतरे में पड़ जाती है9,10।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) सहित महत्वपूर्ण अंगों को संक्रमित कर सकता है, और घातक मेनिनजाइटिस और एन्सेफलाइटिस जैसी गंभीर बीमारियों का कारण बन सकता है, खासकर कमजोर प्रतिरक्षा वाले रोगियों में।हालाँकि, टोक्सोप्लाज्मा गोंडी प्रतिरक्षा सक्षम व्यक्तियों में कोशिका वृद्धि और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित करके संक्रमित मेजबान के वातावरण को भी बदल सकता है, जिससे एक स्पर्शोन्मुख क्रोनिक संक्रमण 9,11 का रखरखाव हो सकता है।दिलचस्प बात यह है कि टी. गोंडी की व्यापकता और ब्रेन ट्यूमर की घटनाओं के बीच संबंध को देखते हुए, कुछ रिपोर्टों से पता चलता है कि क्रोनिक टी. गोंडी संक्रमण के कारण विवो होस्ट पर्यावरणीय परिवर्तन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से मिलते जुलते हैं।
एक्सोसोम को अंतरकोशिकीय संचारक के रूप में जाना जाता है जो पड़ोसी कोशिकाओं से प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित जैविक सामग्री वितरित करते हैं।एक्सोसोम ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में ट्यूमर से संबंधित जैविक प्रक्रियाओं जैसे एंटी-एपोप्टोसिस, एंजियोजेनेसिस और मेटास्टेसिस को प्रभावित कर सकते हैं।विशेष रूप से, miRNAs (miRNAs), लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड लंबाई वाले छोटे गैर-कोडिंग RNA, महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन नियामक हैं जो miRNA-प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (miRISC) के माध्यम से 30% से अधिक मानव mRNA को नियंत्रित करते हैं।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी संक्रमित मेजबानों में miRNA अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके जैविक प्रक्रियाओं को बाधित कर सकता है।मेजबान miRNAs में परजीवी की उत्तरजीविता रणनीति को प्राप्त करने के लिए मेजबान जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण संकेत होते हैं।इस प्रकार, टी. गोंडी से संक्रमण होने पर मेजबान miRNA प्रोफ़ाइल में परिवर्तनों का अध्ययन करने से हमें मेजबान और टी. गोंडी के बीच की बातचीत को अधिक स्पष्ट रूप से समझने में मदद मिल सकती है।दरअसल, थिरुगननम एट अल।15 ने सुझाव दिया कि टी. गोंडी ट्यूमर के विकास से जुड़े विशिष्ट मेजबान miRNAs पर अपनी अभिव्यक्ति को बदलकर मस्तिष्क कार्सिनोजेनेसिस को बढ़ावा देता है और पाया गया कि टी. गोंडी प्रायोगिक जानवरों में ग्लियोमास का कारण बन सकता है।
यह अध्ययन टोक्सोप्लाज्मा बीवी2 से संक्रमित मेजबान माइक्रोग्लिया में एक्सोसोमल एमआईआर-21 के परिवर्तन पर केंद्रित है।हमने फॉक्सओ1/पी27 के नाभिक में अवधारण के कारण यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के विकास में परिवर्तित एक्सोसोमल एमआईआर-21 की संभावित भूमिका देखी, जो कि ओवरएक्सप्रेस्ड एमआईआर-21 का लक्ष्य है।
बीवी2 से प्राप्त एक्सोसोम को विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और सेलुलर घटकों या अन्य पुटिकाओं के साथ संदूषण को रोकने के लिए विभिन्न तरीकों से मान्य किया गया था।एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) ने बीवी2 कोशिकाओं और एक्सोसोम (चित्रा 1 ए) से निकाले गए प्रोटीन के बीच अलग-अलग पैटर्न दिखाए, और एलिक्स की उपस्थिति के लिए नमूनों का मूल्यांकन किया गया, जिसका विश्लेषण एक्सोसोमल प्रोटीन मार्करों के वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था।एलिक्स लेबलिंग एक्सोसोम प्रोटीन में पाई गई लेकिन बीवी2 सेल लाइसेट प्रोटीन में नहीं (चित्र 1बी)।इसके अलावा, बीवी2 से प्राप्त एक्सोसोम से शुद्ध आरएनए का बायोएनालाइज़र का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।18एस और 28एस राइबोसोमल सबयूनिट एक्सोसोमल आरएनए माइग्रेशन पैटर्न में शायद ही कभी देखे गए थे, जो विश्वसनीय शुद्धता का संकेत देता है (चित्र 1सी)।अंत में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से पता चला कि देखे गए एक्सोसोम का आकार लगभग 60-150 एनएम था और इसमें कप जैसी संरचना थी जो एक्सोसोम आकारिकी की विशिष्ट थी (चित्र 1डी)।
BV2 कोशिकाओं से प्राप्त एक्सोसोम का लक्षण वर्णन।(ए) सुरक्षा डेटा शीट पृष्ठ।प्रोटीन को BV2 कोशिकाओं या BV2 से प्राप्त एक्सोसोम से अलग किया गया था।कोशिकाओं और एक्सोसोम के बीच प्रोटीन पैटर्न भिन्न होते हैं।(बी) एक एक्सोसोमल मार्कर (एलिक्स) का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण।(सी) बायोएनालाइज़र का उपयोग करके बीवी2 कोशिकाओं और बीवी2 व्युत्पन्न एक्सोसोम से शुद्ध आरएनए का मूल्यांकन।इस प्रकार, बीवी2 कोशिकाओं में 18एस और 28एस राइबोसोमल सबयूनिट एक्सोसोमल आरएनए में शायद ही कभी पाए गए।(डी) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से पता चला कि बीवी2 कोशिकाओं से पृथक एक्सोसोम 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक रूप से दागे गए थे।एक्सोसोम लगभग 60-150 एनएम आकार और कप के आकार के होते हैं (सॉन्ग और जंग, अप्रकाशित डेटा)।
U87 मानव ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का सेलुलर आंतरिककरण कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था।PKH26 लेबल वाले एक्सोसोम U87 कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत होते हैं।नाभिक को डीएपीआई (छवि 2 ए) के साथ दाग दिया गया था, यह दर्शाता है कि बीवी 2-व्युत्पन्न एक्सोसोम को मेजबान कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जा सकता है और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के वातावरण को प्रभावित कर सकता है।
U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का आंतरिककरण और टोक्सोप्लाज्मा RH से संक्रमित BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम ने U87 ग्लियोमा कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित किया।(ए) कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापे गए यू87 कोशिकाओं से घिरे एक्सोसोम।U87 ग्लियोमा कोशिकाओं को PKH26 (लाल) लेबल वाले एक्सोसोम के साथ या 24 घंटों के लिए नियंत्रण के बिना ऊष्मायन किया गया था।नाभिक को डीएपीआई (नीला) से रंगा गया और फिर एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप (स्केल बार: 10 माइक्रोन, x 3000) के तहत देखा गया।(बी) यू87 ग्लियोमा कोशिका प्रसार कोशिका प्रसार परख द्वारा निर्धारित किया गया था।संकेतित समय के लिए U87 ग्लियोमा कोशिकाओं का एक्सोसोम के साथ इलाज किया गया। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *पी <0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *छात्र के टी-टेस्ट द्वारा पी <0.05। *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *पी <0.05 * पी <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के आंतरिककरण की पुष्टि करने के बाद, हमने मानव ग्लियोमा कोशिकाओं के विकास में BV2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-व्युत्पन्न एक्सोसोम की भूमिका की जांच करने के लिए सेल प्रसार परख की।टी. गोंडी-संक्रमित बीवी2 कोशिकाओं के एक्सोसोम के साथ यू87 कोशिकाओं के उपचार से पता चला कि टी. गोंडी-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के कारण नियंत्रण की तुलना में यू87 कोशिकाओं का काफी अधिक प्रसार हुआ (चित्र 2बी)।
इसके अलावा, U118 कोशिकाओं की वृद्धि के परिणाम U87 के समान थे, क्योंकि टोक्सोप्लाज्मा उत्तेजित एक्सोसोम ने प्रसार के उच्चतम स्तर का कारण बना (डेटा नहीं दिखाया गया)।इन आंकड़ों के आधार पर, हम संकेत दे सकते हैं कि बीवी2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम ग्लियोमा कोशिका प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
ट्यूमर के विकास पर टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल के लिए नग्न चूहों में यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं को इंजेक्ट किया और बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम या आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम इंजेक्ट किया।1 सप्ताह के बाद ट्यूमर स्पष्ट होने के बाद, 5 चूहों के प्रत्येक प्रायोगिक समूह को समान प्रारंभिक बिंदु निर्धारित करने के लिए ट्यूमर के आकार के अनुसार विभाजित किया गया था, और ट्यूमर का आकार 22 दिनों तक मापा गया था।
यू87 ज़ेनोग्राफ़्ट मॉडल वाले चूहों में, 22वें दिन बीवी2-व्युत्पन्न आरएच-संक्रमित एक्सोसोम समूह में काफी बड़े ट्यूमर का आकार और वजन देखा गया (चित्र 3ए,बी)।दूसरी ओर, एक्सोसोम उपचार के बाद बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम समूह और नियंत्रण समूह के बीच ट्यूमर के आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।इसके अलावा, ग्लियोमा कोशिकाओं और एक्सोसोम के इंजेक्शन वाले चूहों ने आरएच-संक्रमित बीवी 2-व्युत्पन्न एक्सोसोम (छवि 3 सी) के समूह में सबसे बड़ी ट्यूमर मात्रा प्रदर्शित की।ये परिणाम दर्शाते हैं कि बीवी2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम माउस ट्यूमर मॉडल में ग्लियोमा वृद्धि को प्रेरित करते हैं।
U87 ज़ेनोग्राफ़्ट माउस मॉडल में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का ऑन्कोजेनेसिस (एसी)।बीवी2 से प्राप्त आरएच-संक्रमित एक्सोसोम से इलाज किए गए बीएएलबी/सी नग्न चूहों में ट्यूमर का आकार (ए) और वजन (बी) काफी बढ़ गया था।BALB/c नग्न चूहों (C) को मैट्रीगेल मिश्रण में निलंबित 1 x 107 U87 कोशिकाओं के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया।इंजेक्शन के छह दिन बाद, चूहों में 100 μg बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का उपचार किया गया।ट्यूमर का आकार और वजन क्रमशः संकेतित दिनों और बलिदान के बाद मापा गया था। *पी <0.05. *पी <0.05. *Р < 0,05. *पी <0.05. *पी <0.05。 *पी <0.05。 *Р < 0,05. *पी <0.05.
डेटा से पता चला कि प्रतिरक्षा या ट्यूमर के विकास से जुड़े 37 miRNAs (16 ओवरएक्सप्रेस्ड और 21 डाउनएक्सप्रेस्ड) को टोक्सोप्लाज्मा आरएच स्ट्रेन (छवि 4 ए) के संक्रमण के बाद माइक्रोग्लिया में महत्वपूर्ण रूप से बदल दिया गया था।परिवर्तित miRNAs के बीच miR-21 के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर की पुष्टि बीवी2 से प्राप्त एक्सोसोम में वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा की गई, बीवी2 और यू87 कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए एक्सोसोम की पुष्टि की गई।एमआईआर-21 की अभिव्यक्ति में टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (आरएच स्ट्रेन) से संक्रमित बीवी2 कोशिकाओं से एक्सोसोम में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (चित्र 4बी)।बीवी2 और यू87 कोशिकाओं में एमआईआर-21 की सापेक्ष अभिव्यक्ति का स्तर परिवर्तित एक्सोसोम के ग्रहण के बाद बढ़ गया (चित्र 4बी)।ट्यूमर रोगियों और टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (एमई49 स्ट्रेन) से संक्रमित चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों में एमआईआर-21 अभिव्यक्ति के सापेक्ष स्तर क्रमशः नियंत्रण की तुलना में अधिक थे (चित्र 4सी)।ये परिणाम इन विट्रो और विवो में अनुमानित और पुष्टि किए गए माइक्रोआरएनए के अभिव्यक्ति स्तरों के बीच अंतर से संबंधित हैं।
टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (आरएच) से संक्रमित माइक्रोग्लिया में एक्सोसोमल एमआईपी-21ए-5पी की अभिव्यक्ति में परिवर्तन।(ए) टी. गोंडी आरएच संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा या ट्यूमर के विकास से जुड़े siRNA में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रदर्शित करता है।(बी) बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम, बीवी2-उपचारित एक्सोसोम और यू87 कोशिकाओं में वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा सापेक्ष एमआईआर-21 अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाया गया था।(सी) ट्यूमर रोगियों (एन=3) और टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (एमई49 स्ट्रेन) (एन=3) से संक्रमित चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों में सापेक्ष एमआईआर-21 अभिव्यक्ति स्तर पाए गए। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *पी <0.05 * पी <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
आरएच-संक्रमित बीवी2 कोशिकाओं से एक्सोसोम्स के कारण विवो और इन विट्रो में ग्लिओमास का विकास हुआ (चित्र 2, 3)।प्रासंगिक एमआरएनए का पता लगाने के लिए, हमने बीवी2 या आरएच बीवी2 से प्राप्त एक्सोसोम से संक्रमित यू87 कोशिकाओं में एंटीट्यूमर लक्ष्य जीन, फोर्कहेड बॉक्स ओ1 (फॉक्सओ1), पीटीईएन और प्रोग्राम्ड सेल डेथ 4 (पीडीसीडी4) के एमआरएनए स्तर की जांच की।जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से पता चला है कि फॉक्सओ1, पीटीईएन और पीडीसीडी4 जीन सहित कई ट्यूमर से जुड़े जीनों में एमआईआर-2121,22 बाइंडिंग साइट हैं।बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम की तुलना में आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम में एंटीट्यूमर लक्ष्य जीन का एमआरएनए स्तर कम हो गया था (चित्र 5ए)।फॉक्सओ1 ने बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम की तुलना में आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम में प्रोटीन का स्तर कम दिखाया (चित्र 5बी)।इन परिणामों के आधार पर, हम पुष्टि कर सकते हैं कि आरएच-संक्रमित बीवी 2 से प्राप्त एक्सोसोम एंटी-ऑन्कोजेनिक जीन को डाउनग्रेड करते हैं, जिससे ट्यूमर के विकास में उनकी भूमिका बनी रहती है।
टोक्सोप्लाज्मा आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम टोक्सोप्लाज्मा आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम द्वारा यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं में एंटीट्यूमर जीन के दमन को प्रेरित करते हैं।(ए) पीबीएस एक्सोसोम की तुलना में टी. गोंडी आरएच-संक्रमित बीवी2 से प्राप्त एक्सोसोम में फॉक्सओ1, पीटीईएन और पीडीसीडी4 अभिव्यक्ति की वास्तविक समय पीसीआर।β-एक्टिन mRNA का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था।(बी) फॉक्सओ1 अभिव्यक्ति वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा निर्धारित की गई थी और इमेजजे प्रोग्राम का उपयोग करके डेंसिटोमेट्री डेटा का सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया था। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *पी <0.05 छात्र के टी परीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था। *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *पी <0.05 * पी <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
ट्यूमर से जुड़े जीन विनियमन पर एक्सोसोम में एमआईपी-21 के प्रभाव को समझने के लिए, यू87 कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके एमआईपी-21 के अवरोधक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और ट्रांसफ़ेक्शन के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को काटा गया था।एमआईआर-21 अवरोधकों से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में फॉक्सओ1 और पी27 अभिव्यक्ति स्तर की तुलना क्यूआरटी-पीसीआर (चित्र 6ए,बी) का उपयोग करके बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम से उपचारित कोशिकाओं से की गई।U87 कोशिकाओं में miR-21 अवरोधक के संक्रमण ने फॉक्सओ1 और पी27 अभिव्यक्ति को काफी हद तक कम कर दिया (चित्र 6)।
आरएच-संक्रमित एक्सोसोमल बीवी2-व्युत्पन्न एमआईपी-21 ने यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं में फॉक्सओ1/पी27 अभिव्यक्ति को बदल दिया।U87 कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके miP-21 अवरोधक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और ट्रांसफ़ेक्शन के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को काटा गया।एमआईआर-21 अवरोधकों से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में फॉक्सओ1 और पी27 अभिव्यक्ति स्तर की तुलना क्यूआरटी-पीसीआर (ए, बी) का उपयोग करके बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम से उपचारित कोशिकाओं के स्तर से की गई।
मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने के लिए, टोक्सोप्लाज्मा परजीवी एक ऊतक पुटी में बदल जाता है।वे मेजबान के पूरे जीवनकाल में मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों सहित विभिन्न ऊतकों को परजीवी बनाते हैं और मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नियंत्रित करते हैं।इसके अलावा, वे मेजबान कोशिकाओं के कोशिका चक्र और एपोप्टोसिस को नियंत्रित कर सकते हैं, जिससे उनके प्रसार को बढ़ावा मिलता है।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी मुख्य रूप से मस्तिष्क माइक्रोग्लिया सहित मेजबान डेंड्राइटिक कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट/मैक्रोफेज वंश को संक्रमित करता है।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एम2 फेनोटाइप के मैक्रोफेज के विभेदन को प्रेरित करता है, रोगज़नक़ संक्रमण के बाद घाव भरने को प्रभावित करता है, और हाइपरवास्कुलराइजेशन और ग्रैनुलोमेटस फाइब्रोसिस से भी जुड़ा होता है।टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण का यह व्यवहारिक रोगजनन ट्यूमर के विकास से जुड़े मार्करों से संबंधित हो सकता है।टोक्सोप्लाज्मा द्वारा नियंत्रित शत्रुतापूर्ण वातावरण संबंधित प्रीकैंसर जैसा हो सकता है।इसलिए, यह माना जा सकता है कि टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण को मस्तिष्क ट्यूमर के विकास में योगदान देना चाहिए।वास्तव में, विभिन्न मस्तिष्क ट्यूमर वाले रोगियों के सीरम में टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण की उच्च दर बताई गई है।इसके अलावा, टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक अन्य कार्सिनोजेनिक प्रभावकारक हो सकता है और अन्य संक्रामक कार्सिनोजेन्स को मस्तिष्क ट्यूमर विकसित करने में मदद करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य कर सकता है।इस संबंध में, यह ध्यान देने योग्य है कि पी. फाल्सीपेरम और एपस्टीन-बार वायरस सहक्रियात्मक रूप से बर्किट लिंफोमा के निर्माण में योगदान करते हैं।
कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में नियामक के रूप में एक्सोसोम की भूमिका की बड़े पैमाने पर जांच की गई है।हालाँकि, परजीवियों और संक्रमित मेजबानों के बीच एक्सोसोम की भूमिका को कम समझा गया है।अब तक, स्रावित प्रोटीन सहित विभिन्न नियामकों ने उन जैविक प्रक्रियाओं की व्याख्या की है जिनके द्वारा प्रोटोजोआ परजीवी मेजबान हमले का विरोध करते हैं और संक्रमण को कायम रखते हैं।हाल ही में, यह अवधारणा बढ़ती जा रही है कि प्रोटोजोआ से जुड़े माइक्रोवेसिकल्स और उनके माइक्रोआरएनए उनके अस्तित्व के लिए अनुकूल वातावरण बनाने के लिए मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं।इसलिए, परिवर्तित एक्सोसोमल miRNAs और ग्लियोमा सेल प्रसार के बीच संबंधों की खोज के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।माइक्रोआरएनए परिवर्तन (क्लस्टर जीन miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 और miR-17-92) टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित मानव मैक्रोफेज में STAT3 प्रमोटर से जुड़ता है, नियंत्रित होता है और एंटी को प्रेरित करता है। -टोक्सोप्लाज्मा गोंडी संक्रमण 29 की प्रतिक्रिया में एपोप्टोसिस।टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण miR-17-5p और miR-106b-5p की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जो कई हाइपरप्रोलिफेरेटिव रोगों 30 से जुड़े होते हैं।इन आंकड़ों से पता चलता है कि टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण द्वारा नियंत्रित मेजबान miRNAs मेजबान जैविक व्यवहार में परजीवी अस्तित्व और रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण अणु हैं।
परिवर्तित miRNAs ग्लिओमास सहित घातक कोशिकाओं की शुरुआत और प्रगति के दौरान विभिन्न प्रकार के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं: विकास संकेतों की आत्मनिर्भरता, विकास-अवरोधक संकेतों के प्रति असंवेदनशीलता, एपोप्टोसिस चोरी, असीमित प्रतिकृति क्षमता, एंजियोजेनेसिस, आक्रमण और मेटास्टेसिस, और सूजन।ग्लियोमा में, कई अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग अध्ययनों में परिवर्तित miRNAs की पहचान की गई है।
वर्तमान अध्ययन में, हमने टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में miRNA-21 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर की पुष्टि की।miR-21 को ग्लियोमास, 33 सहित ठोस ट्यूमर में सबसे अधिक बार व्यक्त होने वाले माइक्रोआरएनए में से एक के रूप में पहचाना गया है और इसकी अभिव्यक्ति ग्लियोमा के ग्रेड के साथ संबंधित है।एकत्रित साक्ष्यों से पता चलता है कि एमआईआर-21 एक नया ऑन्कोजीन है जो ग्लियोमा वृद्धि में एक एंटी-एपोप्टोटिक कारक के रूप में कार्य करता है और मानव मस्तिष्क की घातकताओं के ऊतकों और प्लाज्मा में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है।दिलचस्प बात यह है कि ग्लियोमा कोशिकाओं और ऊतकों में miR-21 का निष्क्रिय होना कैसपेज़-निर्भर एपोप्टोसिस के कारण कोशिका प्रसार के अवरोध को ट्रिगर करता है।एमआईआर-21 पूर्वानुमानित लक्ष्यों के जैव सूचनात्मक विश्लेषण से एपोप्टोसिस मार्गों से जुड़े कई ट्यूमर शमन जीनों का पता चला, जिनमें एमआईआर-2121 बाइंडिंग साइट के साथ प्रोग्राम्ड सेल डेथ 4 (पीडीसीडी4), ट्रोपोमायोसिन (टीपीएम1), पीटीईएन और फोर्कहेड बॉक्स ओ1 (फॉक्सओ1) शामिल हैं।.22.38.
फॉक्सओ1, प्रतिलेखन कारकों (फॉक्सओ) में से एक के रूप में, विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर के विकास में शामिल है और पी21, पी27, बीआईएम और एफएएसएल40 जैसे ट्यूमर दमन जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकता है।फॉक्सओ1 कोशिका वृद्धि को दबाने के लिए पी27 जैसे कोशिका चक्र अवरोधकों को बांध और सक्रिय कर सकता है।इसके अलावा, फॉक्सओ1 पीआई3के/एक्ट सिग्नलिंग का एक प्रमुख प्रभावक है और पी2742 प्रतिलेखन के सक्रियण के माध्यम से कई जैविक प्रक्रियाओं जैसे सेल चक्र प्रगति और सेल भेदभाव को नियंत्रित करता है।
निष्कर्ष में, हमारा मानना ​​​​है कि टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित माइक्रोग्लिया से प्राप्त एक्सोसोमल एमआईआर-21 ग्लियोमा कोशिकाओं के विकास नियामक के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है (चित्र 7)।हालाँकि, एक्सोसोमल एमआईआर-21, परिवर्तित टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण और ग्लियोमा वृद्धि के बीच सीधा संबंध खोजने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।इन परिणामों से टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण और ग्लियोमा की घटनाओं के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने की उम्मीद है।
इस अध्ययन में ग्लियोमा (मस्तिष्क) कार्सिनोजेनेसिस के तंत्र का एक योजनाबद्ध आरेख प्रस्तावित है।लेखक PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA) में चित्रित करता है।
इस अध्ययन में जानवरों के उपयोग सहित सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी पशु देखभाल और उपयोगकर्ता समिति मानक नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार थे और सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (आईआरबी संख्या एसएनयू-) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे। 150715).-2).सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं ARRIVE सिफारिशों के अनुसार की गईं।
बीवी2 माउस माइक्रोग्लिया और यू87 मानव ग्लियोमा कोशिकाओं को क्रमशः डुल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम; वेल्जीन, सियोल, कोरिया) और रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट के मीडियम (आरपीएमआई; वेलजीन) में संवर्धित किया गया, प्रत्येक में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 एमएम एल- शामिल था। ग्लूटामाइन, 0.2 एमएम पेनिसिलिन और 0.05 एमएम स्ट्रेप्टोमाइसिन।कोशिकाओं को 37°C पर 5% CO2 के साथ एक इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया।U87 कोशिकाओं के साथ तुलना के लिए एक अन्य ग्लियोमा सेल लाइन, U118 का उपयोग किया गया था।
टी. गोंडी-संक्रमित आरएच और एमई49 उपभेदों से एक्सोसोम को अलग करने के लिए, टी. गोंडी टैचीज़ोइट्स (आरएच स्ट्रेन) को 3-4 दिन पहले इंजेक्ट किए गए 6-सप्ताह पुराने BALB/c चूहों के पेट की गुहा से काटा गया था।टैचिज़ोइट्स को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और 40% पेरकोल (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) 43 में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया।तनाव ME49 के टैचीज़ोइट्स प्राप्त करने के लिए, BALB/c चूहों को 20 ऊतक सिस्ट के साथ अंतःपरिवर्तन में इंजेक्ट किया गया था और संक्रमण (पीआई) के 6-8 वें दिन पेट की गुहा को धोकर सिस्ट में टैचीज़ोइट परिवर्तन एकत्र किया गया था।चूहे पीबीएस से संक्रमित.ME49 टैचीज़ोइट्स को 100 μg/ml पेनिसिलिन (गिब्को/BRL, ग्रैंड आइलैंड, NY, यूएसए), 100 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को/BRL), और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (लोन्ज़ा, वॉकर्सविले, एमडी) के साथ पूरक कोशिकाओं में उगाया गया था। .., यूएसए) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर।वेरो कोशिकाओं में खेती के बाद, मलबे और कोशिकाओं को हटाने के लिए ME49 टैचीज़ोइट्स को 25 गेज सुई के माध्यम से दो बार और फिर 5 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया।धोने के बाद, टैचीज़ोइट्स को पीबीएस44 में फिर से निलंबित कर दिया गया।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी स्ट्रेन ME49 के ऊतक सिस्ट को संक्रमित C57BL/6 चूहों (ओरिएंट बायो एनिमल सेंटर, सेओंगनाम, कोरिया) के मस्तिष्क से पृथक सिस्ट के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बनाए रखा गया था।ME49-संक्रमित चूहों के दिमाग को पीआई के 3 महीने के बाद काटा गया और सिस्ट को अलग करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे काटा गया।संक्रमित चूहों को सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में विशेष रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों (एसपीएफ़) के तहत रखा गया था।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार miRNeasy मिनी किट (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम, BV2 कोशिकाओं और ऊतकों से कुल RNA निकाला गया, जिसमें रेफरेंस चरण के लिए ऊष्मायन समय भी शामिल था।आरएनए सांद्रता नैनोड्रॉप 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर निर्धारित की गई थी।आरएनए माइक्रोएरे की गुणवत्ता का आकलन एगिलेंट 2100 बायोएनालाइजर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, अम्स्टेलवीन, नीदरलैंड्स) का उपयोग करके किया गया था।
10% एक्सोसोम-खराब एफबीएस के साथ डीएमईएम को 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 100,000 ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा तैयार किया गया था और 0.22 माइक्रोन फिल्टर (नलगीन, रोचेस्टर, एनवाई, यूएसए) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था।बीवी2 कोशिकाओं, 5 × 105, को डीएमईएम में 10% एक्सोसोम-क्षीण एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक्स 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संवर्धित किया गया।ऊष्मायन के 24 घंटों के बाद, स्ट्रेन आरएच या एमई49 (एमओआई = 10) के टैचीज़ोइट्स को कोशिकाओं में जोड़ा गया और गैर-आक्रमणकारी परजीवियों को एक घंटे के भीतर हटा दिया गया और डीएमईएम से फिर से भर दिया गया।बीवी2 कोशिकाओं से एक्सोसोम को संशोधित विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया, जो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है।आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए 300 μl पीबीएस में एक्सोसोम गोली को पुनः निलंबित करें।पृथक एक्सोसोम की सांद्रता बीसीए प्रोटीन परख किट (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) और नैनोड्रॉप 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।
BV2 कोशिकाओं से अवक्षेप या BV2 से प्राप्त एक्सोसोम को PRO-PREP™ प्रोटीन निष्कर्षण समाधान (iNtRon बायोटेक्नोलॉजी, सेओंगनाम, कोरिया) में मिलाया गया और प्रोटीन को कूमैसी ब्रिलियंट ब्लू स्टेन्ड 10% SDS पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर लोड किया गया।इसके अलावा, प्रोटीन को 2 घंटे के लिए पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया।वेस्टर्न ब्लॉट्स को एक्सोसोमल मार्कर के रूप में एलिक्स एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, बेवर्ली, एमए, यूएसए) का उपयोग करके मान्य किया गया था।एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) (बेथाइल लेबोरेटरीज, मोंटगोमरी, टीएक्स, यूएसए) और एक एलएएस-1000 प्लस ल्यूमिनसेंट छवि विश्लेषक (फ़ूजी फोटोग्राफिक फिल्म, टोक्यो, जापान) का उपयोग द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में किया गया था।.एक्सोसोम के आकार और आकारिकी का अध्ययन करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया।BV2 कोशिकाओं (6.40 µg/µl) से अलग किए गए एक्सोसोम को कार्बन-लेपित जालों पर तैयार किया गया और 1 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक रूप से दाग दिया गया।तैयार किए गए नमूनों को ES1000W एर्लांगशेन सीसीडी कैमरा (गैटन, प्लिसटन, सीए, यूएसए) से सुसज्जित जेईओएल 1200-ईएक्स II (टोक्यो, जापान) का उपयोग करके 80 केवी के त्वरित वोल्टेज पर देखा गया।
बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीकेएच26 रेड फ्लोरोसेंट लिंकर किट (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके दाग दिया गया था।U87 कोशिकाएं, 2×105, PKH26-लेबल वाले एक्सोसोम (लाल) या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई एक्सोसोम के साथ, 5% CO2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।U87 सेल नाभिक को DAPI (नीला) के साथ दाग दिया गया था, U87 कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और फिर लेईका टीसीएस एसपी8 एसटीईडी सीडब्ल्यू कन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, मैनहेम, जर्मनी) में विश्लेषण किया गया था।देखने योग्य.
सीडीएनए को मीर-एक्स सीआरएनए प्रथम स्ट्रैंड संश्लेषण और एसवाईबीआर क्यूआरटी-पीसीआर किट (तकरा बायो इंक, शिगा, जापान) का उपयोग करके सीआरएनए से संश्लेषित किया गया था।वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर को एसवाईबीआर प्रीमिक्स के साथ मिश्रित प्राइमरों और टेम्पलेट्स का उपयोग करके iQ5 वास्तविक समय पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था।डीएनए को विकृतीकरण के 40 चक्रों के लिए 95°C पर 15 सेकंड के लिए प्रवर्धित किया गया और 60°C पर 60 सेकंड के लिए एनीलिंग किया गया।प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के डेटा का विश्लेषण iQ™5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर (बायो-रेड) के डेटा विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करके किया गया था।चयनित लक्ष्य जीन और β-actin/siRNA (और U6) के बीच जीन अभिव्यक्ति में सापेक्ष परिवर्तन की गणना मानक वक्र विधि का उपयोग करके की गई थी।प्रयुक्त प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं।
3 x 104 U87 ग्लियोमा कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में डाला गया और 12, 18 और 36 घंटों में नियंत्रण के रूप में BV2 (50 μg/mL) से प्राप्त टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम या BV2 (50 μg/mL) से प्राप्त नॉनपल्स एक्सोसोम के साथ मिलाया गया। .सेल प्रसार दर सेल काउंटिंग किट-8 (डोजिंदो, कुमामोटो, जापान) (पूरक आंकड़े एस1-एस3) 46 का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।
5-सप्ताह की मादा BALB/c नग्न चूहों को ओरिएंट बायो (सियोंगनाम-सी, दक्षिण कोरिया) से खरीदा गया था और कमरे के तापमान (22±2°C) और आर्द्रता (45±15°C) पर बाँझ पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से रखा गया था।% कमरे के तापमान (22±2°C) और आर्द्रता (45±15%) पर।एसपीएफ़ (सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ़ मेडिसिन एनिमल सेंटर) के तहत 12 घंटे का प्रकाश चक्र और 12 घंटे का अंधेरा चक्र किया गया।चूहों को बेतरतीब ढंग से 5 चूहों के तीन समूहों में विभाजित किया गया था और सभी समूहों को पीबीएस के 400 मिलीलीटर के साथ इंजेक्शन दिया गया था जिसमें 1 x 107 यू87 ग्लियोमा कोशिकाएं और वृद्धि कारक कम बीडी मैट्रिगेल ™ (बीडी साइंस, मियामी, एफएल, यूएसए) था।ट्यूमर इंजेक्शन के छह दिन बाद, बीवी2 कोशिकाओं से प्राप्त 200 मिलीग्राम एक्सोसोम (टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण के साथ/बिना) को ट्यूमर साइट में इंजेक्ट किया गया।ट्यूमर के संक्रमण के बाईस दिन बाद, प्रत्येक समूह में चूहों के ट्यूमर का आकार सप्ताह में तीन बार कैलीपर से मापा गया, और ट्यूमर की मात्रा की गणना सूत्र द्वारा की गई: 0.5×(चौड़ाई)×2×लंबाई।
miRCURYTM LNA miRNA सरणी का उपयोग करते हुए माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण, 7वीं पीढ़ी में mmu और rno सारणी (EXIQON, वेदबेक, डेनमार्क) हैं जो 3100 मानव, माउस और चूहे miRNA कैप्चर जांच के बीच 1119 अच्छी तरह से विशेषता वाले चूहों को कवर करते हैं।इस प्रक्रिया के दौरान, कुल आरएनए के 250 से 1000 एनजी को बछड़े के आंतों के क्षारीय फॉस्फेट के साथ उपचार के बाद 5′-फॉस्फेट से हटा दिया गया और उसके बाद Hy3 हरी फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया।लेबल किए गए नमूनों को हाइब्रिडाइजेशन चैंबर किट (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) और हाइब्रिडाइजेशन स्लाइड किट (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके माइक्रोएरे स्लाइड लोड करके हाइब्रिड किया गया था।56 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे तक संकरण किया गया, फिर निर्माता की सिफारिशों के अनुसार माइक्रोएरे को धोया गया।संसाधित माइक्रोएरे स्लाइड्स को फिर Agilent G2565CA माइक्रोएरे स्कैनर सिस्टम (Agilent Technologies) का उपयोग करके स्कैन किया गया।स्कैन की गई छवियों को एगिलेंट फ़ीचर एक्सट्रैक्शन सॉफ़्टवेयर संस्करण 10.7.3.1 (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके आयात किया गया था और प्रत्येक छवि की प्रतिदीप्ति तीव्रता को संशोधित एक्सिकॉन प्रोटोकॉल की संबंधित जीएएल फ़ाइल का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।वर्तमान अध्ययन के लिए माइक्रोएरे डेटा परिग्रहण संख्या GPL32397 के तहत GEO डेटाबेस में जमा किया गया है।
टोक्सोप्लाज्मा से संक्रमित आरएच या एमई49 उपभेदों के माइक्रोग्लिया में परिपक्व एक्सोसोमल miRNAs की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विभिन्न नेटवर्क उपकरणों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।ट्यूमर के विकास से जुड़े miRNAs की पहचान miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) का उपयोग करके की गई और 8.0 से अधिक सामान्यीकृत सिग्नल तीव्रता (लॉग2) के साथ फ़िल्टर किया गया।miRNAs के बीच, टी. गोंडी से संक्रमित RH या ME49 उपभेदों द्वारा परिवर्तित miRNAs के फ़िल्टर विश्लेषण द्वारा विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs को 1.5 गुना से अधिक बदला हुआ पाया गया।
कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इन्विट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके ऑप्टी-एमईएम (गिब्को, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) में छह-वेल प्लेटों (3 x 105 सेल/वेल) में डाला गया था।ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 6 घंटे तक सुसंस्कृत किया गया और फिर माध्यम को ताज़ा पूर्ण माध्यम में बदल दिया गया।अभिकर्मक के 24 घंटे बाद कोशिकाओं की कटाई की गई।
सांख्यिकीय विश्लेषण मुख्य रूप से एक्सेल सॉफ्टवेयर (माइक्रोसॉफ्ट, वाशिंगटन, डीसी, यूएसए) के साथ छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था।प्रायोगिक पशु विश्लेषण के लिए, प्रिज्म 3.0 सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, ला जोला, सीए, यूएसए) का उपयोग करके दो-तरफा एनोवा का प्रदर्शन किया गया। पी-मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी-मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 पी 值<0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (आईआरबी संख्या एसएनयू-150715-2) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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