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फुफ्फुसीय सिस्टिक फाइब्रोसिस के उपचार के लिए जीन वैक्टर को प्रवाहकीय वायुमार्ग पर लक्षित किया जाना चाहिए, क्योंकि परिधीय फेफड़े के पारगमन का कोई चिकित्सीय प्रभाव नहीं होता है।वायरल ट्रांसडक्शन की दक्षता सीधे वाहक के निवास समय से संबंधित है।हालाँकि, जीन वाहक जैसे डिलीवरी तरल पदार्थ साँस लेने के दौरान स्वाभाविक रूप से एल्वियोली में फैल जाते हैं, और किसी भी आकार के चिकित्सीय कणों को म्यूकोसिलरी परिवहन द्वारा तेजी से हटा दिया जाता है।श्वसन पथ में जीन वाहकों के निवास समय को बढ़ाना महत्वपूर्ण है लेकिन इसे प्राप्त करना कठिन है।वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जिन्हें श्वसन पथ की सतह पर निर्देशित किया जा सकता है, क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण में सुधार कर सकते हैं।विवो इमेजिंग में समस्याओं के कारण, लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतह पर ऐसे छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार को कम समझा जाता है।इस अध्ययन का उद्देश्य विवो में एकल और थोक कणों के व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एनेस्थेटाइज्ड चूहों के श्वासनली में चुंबकीय कणों की एक श्रृंखला के आंदोलन को विवो में देखने के लिए सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग का उपयोग करना था।फिर हमने यह भी मूल्यांकन किया कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में लेंटीवायरल चुंबकीय कणों की डिलीवरी से चूहे की श्वासनली में पारगमन की दक्षता में वृद्धि होगी।सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग इन विट्रो और विवो में स्थिर और गतिशील चुंबकीय क्षेत्रों में चुंबकीय कणों के व्यवहार को दिखाती है।चुम्बक का उपयोग करके कणों को आसानी से जीवित वायुमार्ग की सतह पर नहीं खींचा जा सकता है, लेकिन परिवहन के दौरान, जमाव दृश्य क्षेत्र में केंद्रित होते हैं, जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है।जब लेंटीवायरल चुंबकीय कणों को चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में पहुंचाया गया तो पारगमन दक्षता भी छह गुना बढ़ गई थी।कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि लेंटिवायरल चुंबकीय कण और चुंबकीय क्षेत्र विवो में प्रवाहकीय वायुमार्ग में जीन वेक्टर लक्ष्यीकरण और पारगमन स्तर में सुधार के लिए मूल्यवान दृष्टिकोण हो सकते हैं।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टर रेगुलेटर (सीएफटीआर) नामक एकल जीन में भिन्नता के कारण होता है।सीएफटीआर प्रोटीन एक आयन चैनल है जो वायुमार्ग सहित पूरे शरीर में कई उपकला कोशिकाओं में मौजूद होता है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस के रोगजनन में एक प्रमुख स्थल है।सीएफटीआर में दोष के कारण असामान्य जल परिवहन, वायुमार्ग की सतह का निर्जलीकरण और वायुमार्ग की सतह द्रव परत (एएसएल) की गहराई में कमी आती है।यह साँस के कणों और रोगजनकों के वायुमार्ग को साफ़ करने के लिए म्यूकोसिलरी ट्रांसपोर्ट (एमसीटी) प्रणाली की क्षमता को भी ख़राब कर देता है।हमारा लक्ष्य सीएफटीआर जीन की सही प्रतिलिपि प्रदान करने और एएसएल, एमसीटी और फेफड़ों के स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए लेंटिवायरल (एलवी) जीन थेरेपी विकसित करना है, और नई प्रौद्योगिकियों को विकसित करना जारी रखना है जो विवो1 में इन मापदंडों को माप सकते हैं।
एलवी वैक्टर सिस्टिक फाइब्रोसिस जीन थेरेपी के लिए अग्रणी उम्मीदवारों में से एक हैं, मुख्यतः क्योंकि वे चिकित्सीय जीन को वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं (एयरवे स्टेम सेल) में स्थायी रूप से एकीकृत कर सकते हैं।यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वे सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े कार्यात्मक जीन-सुधारित वायुमार्ग सतह कोशिकाओं में अंतर करके सामान्य जलयोजन और बलगम निकासी को बहाल कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आजीवन लाभ होता है।एलवी वैक्टर को प्रवाहकीय वायुमार्ग के विरुद्ध निर्देशित किया जाना चाहिए, क्योंकि यहीं से सीएफ में फेफड़ों की भागीदारी शुरू होती है।फेफड़ों में गहराई तक वेक्टर के पहुंचने से वायुकोशीय पारगमन हो सकता है, लेकिन सिस्टिक फाइब्रोसिस में इसका कोई चिकित्सीय प्रभाव नहीं होता है।हालाँकि, बच्चे के जन्म के बाद साँस लेने पर जीन वाहक जैसे तरल पदार्थ स्वाभाविक रूप से एल्वियोली में चले जाते हैं और चिकित्सीय कणों को एमसीटी द्वारा तेजी से मौखिक गुहा में निष्कासित कर दिया जाता है।एलवी पारगमन की दक्षता सीधे उस समय की लंबाई से संबंधित होती है जब वेक्टर सेलुलर ग्रहण की अनुमति देने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के करीब रहता है - "निवास समय" 5 जिसे विशिष्ट क्षेत्रीय वायु प्रवाह के साथ-साथ बलगम और एमसीटी कणों के समन्वित ग्रहण द्वारा आसानी से छोटा किया जाता है।सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए, इस क्षेत्र में उच्च स्तर के पारगमन को प्राप्त करने के लिए वायुमार्ग में एलवी निवास समय को बढ़ाने की क्षमता महत्वपूर्ण है, लेकिन अब तक चुनौतीपूर्ण रही है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हमारा प्रस्ताव है कि एलवी चुंबकीय कण (एमपी) दो पूरक तरीकों से मदद कर सकते हैं।सबसे पहले, उन्हें लक्ष्यीकरण में सुधार करने और जीन वाहक कणों को वायुमार्ग के सही क्षेत्र में रहने में मदद करने के लिए वायुमार्ग की सतह पर एक चुंबक द्वारा निर्देशित किया जा सकता है;और एएसएल) कोशिका परत में चले जाते हैं 6. एमपी को व्यापक रूप से लक्षित दवा वितरण वाहनों के रूप में उपयोग किया जाता है जब वे एंटीबॉडी, कीमोथेरेपी दवाओं, या अन्य छोटे अणुओं से जुड़ते हैं जो कोशिका झिल्ली से जुड़ते हैं या अपने संबंधित कोशिका सतह रिसेप्टर्स से जुड़ते हैं और ट्यूमर साइटों पर जमा होते हैं। स्थैतिक बिजली की उपस्थिति.कैंसर चिकित्सा के लिए चुंबकीय क्षेत्र 7. अन्य "हाइपरथर्मिक" तरीकों का उद्देश्य दोलनशील चुंबकीय क्षेत्रों के संपर्क में आने पर एमपी को गर्म करके ट्यूमर कोशिकाओं को मारना है।चुंबकीय अभिकर्मक का सिद्धांत, जिसमें एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कोशिकाओं में डीएनए के स्थानांतरण को बढ़ाने के लिए एक अभिकर्मक एजेंट के रूप में किया जाता है, आमतौर पर कठिन-से-ट्रांसड्यूस सेल लाइनों के लिए गैर-वायरल और वायरल जीन वैक्टर की एक श्रृंखला का उपयोग करके इन विट्रो में उपयोग किया जाता है। ..एक स्थिर चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में मानव ब्रोन्कियल एपिथेलियम की सेल लाइन में एलवी एमपी की इन विट्रो डिलीवरी के साथ एलवी मैग्नेटोट्रांसफेक्शन की दक्षता स्थापित की गई, जिससे अकेले एलवी वेक्टर की तुलना में ट्रांसडक्शन की दक्षता 186 गुना बढ़ गई।एलवी एमटी को सिस्टिक फाइब्रोसिस के इन विट्रो मॉडल पर भी लागू किया गया है, जहां चुंबकीय ट्रांसफ़ेक्शन ने सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक10 की उपस्थिति में एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस संस्कृतियों में एलवी ट्रांसडक्शन को 20 गुना बढ़ा दिया है।हालाँकि, विवो अंग मैग्नेटोट्रांसफ़ेक्शन में अपेक्षाकृत कम ध्यान दिया गया है और इसका मूल्यांकन केवल कुछ जानवरों के अध्ययन11,12,13,14,15 में किया गया है, खासकर फेफड़ों में।हालाँकि, सिस्टिक फाइब्रोसिस में फेफड़ों की चिकित्सा में चुंबकीय अभिकर्मक की संभावनाएँ स्पष्ट हैं।टैन एट अल.(2020) ने कहा कि "चुंबकीय नैनोकणों की प्रभावी फुफ्फुसीय डिलीवरी पर एक सत्यापन अध्ययन सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले रोगियों में नैदानिक ​​​​परिणामों में सुधार के लिए भविष्य में सीएफटीआर इनहेलेशन रणनीतियों का मार्ग प्रशस्त करेगा"6।
लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में श्वसन पथ की सतह पर छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार की कल्पना करना और अध्ययन करना मुश्किल है, और इसलिए उन्हें कम समझा जाता है।अन्य अध्ययनों में, हमने गैस चैनल सतह जलयोजन को सीधे मापने के लिए एएसएल18 गहराई और एमसीटी19 व्यवहार,20 में गैर-आक्रामक इमेजिंग और मिनटों के विवो परिवर्तनों की मात्रा का ठहराव के लिए एक सिंक्रोट्रॉन प्रसार आधारित चरण कंट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (पीबी-पीसीएक्सआई) विधि विकसित की है। और उपचार प्रभावशीलता के प्रारंभिक संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है।इसके अलावा, हमारी एमसीटी स्कोरिंग विधि पीबी-पीसीएक्सआई21 के साथ दिखाई देने वाले एमसीटी मार्कर के रूप में एल्यूमिना या उच्च अपवर्तक सूचकांक ग्लास से बने 10-35 µm व्यास के कणों का उपयोग करती है।दोनों विधियाँ एमपी सहित विभिन्न प्रकार के कणों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं।
उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के कारण, हमारे पीबी-पीसीएक्सआई-आधारित एएसएल और एमसीटी परीक्षण विवो में एकल और थोक कणों की गतिशीलता और व्यवहार पैटर्न का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं ताकि हमें एमपी जीन वितरण विधियों को समझने और अनुकूलित करने में मदद मिल सके।यहां हम जिस दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं वह SPring-8 BL20B2 बीमलाइन का उपयोग करके हमारे अध्ययनों पर आधारित है, जिसमें हमने चूहों के नाक और फुफ्फुसीय वायुमार्ग में एक डमी वेक्टर की खुराक की डिलीवरी के बाद द्रव आंदोलन की कल्पना की है ताकि हमारे विषम जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को समझाने में मदद मिल सके। हमारे जीन में.3.4 की वाहक खुराक के साथ पशु अध्ययन।
इस अध्ययन का उद्देश्य जीवित चूहों के श्वासनली में सांसदों की एक श्रृंखला के विवो आंदोलनों की कल्पना करने के लिए पीबी-पीसीएक्सआई सिंक्रोट्रॉन का उपयोग करना था।ये पीबी-पीसीएक्सआई इमेजिंग अध्ययन एमपी श्रृंखला, चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और एमपी आंदोलन पर उनके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए स्थान का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किए गए थे।हमने मान लिया कि एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र वितरित एमएफ को लक्ष्य क्षेत्र में रहने या स्थानांतरित करने में मदद करेगा।इन अध्ययनों ने हमें चुंबक विन्यास निर्धारित करने की भी अनुमति दी जो जमाव के बाद श्वासनली में बचे कणों की मात्रा को अधिकतम करती है।अध्ययन की दूसरी श्रृंखला में, हमने चूहे के वायुमार्ग में एलवी-एमपी की विवो डिलीवरी के परिणामस्वरूप होने वाले ट्रांसडक्शन पैटर्न को प्रदर्शित करने के लिए इस इष्टतम कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करने का लक्ष्य रखा, इस धारणा पर कि वायुमार्ग लक्ष्यीकरण के संदर्भ में एलवी-एमपी की डिलीवरी का परिणाम होगा बढ़ी हुई एलवी ट्रांसडक्शन दक्षता में।.
सभी जानवरों पर अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय (एम-2019-060 और एम-2020-022) और एसपीरिंग-8 सिंक्रोट्रॉन एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किए गए थे।प्रयोग ARRIVE की सिफ़ारिशों के अनुसार किए गए।
सभी एक्स-रे छवियां जापान में SPring-8 सिंक्रोट्रॉन में BL20XU बीमलाइन पर पहले वर्णित 21,22 के समान सेटअप का उपयोग करके ली गई थीं।संक्षेप में, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंग से 245 मीटर की दूरी पर स्थित था।चरण कंट्रास्ट प्रभाव पैदा करने के लिए कण इमेजिंग अध्ययन के लिए 0.6 मीटर की नमूना-से-डिटेक्टर दूरी का उपयोग किया जाता है और विवो इमेजिंग अध्ययन के लिए 0.3 मीटर का उपयोग किया जाता है।25 केवी की ऊर्जा वाली एक मोनोक्रोमैटिक किरण का उपयोग किया गया था।छवियां एक एससीएमओएस डिटेक्टर से जुड़े उच्च रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे ट्रांसड्यूसर (एसपीरिंग -8 बीएम 3) का उपयोग करके हासिल की गईं।ट्रांसड्यूसर 10 माइक्रोन मोटे सिंटिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) का उपयोग करके एक्स-रे को दृश्य प्रकाश में परिवर्तित करता है, जिसे फिर ×10 (NA 0.3) माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग करके sCMOS सेंसर की ओर निर्देशित किया जाता है।एससीएमओएस डिटेक्टर एक ओर्का-फ्लैश4.0 (हमामात्सू फोटोनिक्स, जापान) था जिसका सरणी आकार 2048 × 2048 पिक्सल और कच्चा पिक्सेल आकार 6.5 × 6.5 µm था।यह सेटिंग 0.51 µm का प्रभावी आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार और लगभग 1.1 मिमी × 1.1 मिमी का दृश्य क्षेत्र देती है।श्वास के कारण होने वाली गति कलाकृतियों को कम करते हुए वायुमार्ग के अंदर और बाहर चुंबकीय कणों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए 100 एमएस की एक्सपोज़र अवधि को चुना गया था।विवो अध्ययनों के लिए, एक्सपोज़र के बीच एक्स-रे बीम को अवरुद्ध करके विकिरण खुराक को सीमित करने के लिए एक्स-रे पथ में एक तेज़ एक्स-रे शटर रखा गया था।
किसी भी SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अध्ययन में LV मीडिया का उपयोग नहीं किया गया क्योंकि BL20XU इमेजिंग कक्ष जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रमाणित नहीं है।इसके बजाय, हमने आकार, सामग्री, लौह सांद्रता और अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला को कवर करने वाले दो वाणिज्यिक विक्रेताओं से अच्छी तरह से विशेषता वाले एमपी की एक श्रृंखला का चयन किया, - पहले यह समझने के लिए कि चुंबकीय क्षेत्र ग्लास केशिकाओं में एमपी के आंदोलन को कैसे प्रभावित करते हैं, और फिर जीवित वायुमार्ग.सतह।एमपी का आकार 0.25 से 18 µm तक भिन्न होता है और इसे विभिन्न सामग्रियों से बनाया जाता है (तालिका 1 देखें), लेकिन एमपी में चुंबकीय कणों के आकार सहित प्रत्येक नमूने की संरचना अज्ञात है।हमारे व्यापक एमसीटी अध्ययन 19, 20, 21, 23, 24 के आधार पर, हम उम्मीद करते हैं कि 5 µm तक के एमपी को श्वासनली वायुमार्ग की सतह पर देखा जा सकता है, उदाहरण के लिए, एमपी आंदोलन की बेहतर दृश्यता देखने के लिए लगातार फ्रेम घटाकर।0.25 µm का एक एमपी इमेजिंग डिवाइस के रिज़ॉल्यूशन से छोटा है, लेकिन पीबी-पीसीएक्सआई से उनके वॉल्यूमेट्रिक कंट्रास्ट और सतह तरल की गति का पता लगाने की उम्मीद की जाती है जिस पर वे जमा होने के बाद जमा होते हैं।
तालिका में प्रत्येक सांसद के लिए नमूने।1 को 0.63 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 20 μl ग्लास केशिकाओं (ड्रमंड माइक्रोकैप्स, पीए, यूएसए) में तैयार किया गया था।कणिका कण पानी में उपलब्ध होते हैं, जबकि कॉम्बीमैग कण निर्माता के स्वामित्व वाले तरल में उपलब्ध होते हैं।प्रत्येक ट्यूब को तरल (लगभग 11 μl) से आधा भरा जाता है और नमूना धारक पर रखा जाता है (चित्र 1 देखें)।कांच की केशिकाओं को क्रमशः इमेजिंग कक्ष में मंच पर क्षैतिज रूप से रखा गया था, और तरल के किनारों पर स्थित किया गया था।1.17 टी के अवशेष के साथ दुर्लभ पृथ्वी, नियोडिमियम, लौह और बोरान (एनडीएफईबी) (एन35, बिल्ली संख्या एलएम1652, जयकार इलेक्ट्रॉनिक्स, ऑस्ट्रेलिया) से बना 19 मिमी व्यास (28 मिमी लंबा) निकल-शेल चुंबक एक से जुड़ा हुआ था। रेंडरिंग के दौरान अपनी स्थिति को दूरस्थ रूप से बदलने के लिए अलग ट्रांसफर टेबल।एक्स-रे इमेजिंग तब शुरू होती है जब चुंबक नमूने से लगभग 30 मिमी ऊपर स्थित होता है और छवियां 4 फ्रेम प्रति सेकंड पर प्राप्त की जाती हैं।इमेजिंग के दौरान, चुंबक को कांच की केशिका ट्यूब के करीब लाया गया (लगभग 1 मिमी की दूरी पर) और फिर क्षेत्र की ताकत और स्थिति के प्रभाव का आकलन करने के लिए ट्यूब के साथ ले जाया गया।
एक्सवाई नमूने के अनुवाद के चरण में ग्लास केशिकाओं में एमपी नमूने युक्त इन विट्रो इमेजिंग सेटअप।एक्स-रे किरण का पथ लाल बिंदीदार रेखा से चिह्नित होता है।
एक बार जब सांसदों की इन विट्रो दृश्यता स्थापित हो गई, तो उनमें से एक उपसमूह का जंगली प्रकार की मादा विस्टार अल्बिनो चूहों (~ 12 सप्ताह पुरानी, ​​~ 200 ग्राम) पर विवो में परीक्षण किया गया।मेडेटोमिडाइन 0.24 मिलीग्राम/किग्रा (डोमिटर®, ज़ेनोएक, जापान), मिडाज़ोलम 3.2 मिलीग्राम/किग्रा (डॉर्मिकम®, एस्टेलस फार्मा, जापान) और ब्यूटोरफेनॉल 4 मिलीग्राम/किग्रा (वेटोरफेल®, मीजी सेइका)।इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को फार्मा (जापान) मिश्रण से बेहोश किया गया।एनेस्थीसिया के बाद, उन्हें श्वासनली के चारों ओर के बालों को हटाकर, एक एंडोट्रैचियल ट्यूब (ईटी; 16 गा अंतःशिरा प्रवेशनी, टेरुमो बीसीटी) डालकर इमेजिंग के लिए तैयार किया गया था, और उन्हें एक थर्मल बैग युक्त कस्टम-निर्मित इमेजिंग प्लेट पर लापरवाह स्थिति में स्थिर किया गया था। शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए.22. इमेजिंग प्लेट को एक्स-रे छवि पर क्षैतिज रूप से श्वासनली को संरेखित करने के लिए एक मामूली कोण पर इमेजिंग बॉक्स में नमूना चरण से जोड़ा गया था जैसा कि चित्र 2 ए में दिखाया गया है।
(ए) एसपीरिंग-8 इमेजिंग यूनिट में विवो इमेजिंग सेटअप में, एक्स-रे बीम पथ को लाल बिंदीदार रेखा से चिह्नित किया गया है।(बी,सी) ट्रेकिअल चुंबक स्थानीयकरण को दो ऑर्थोगोनली माउंटेड आईपी कैमरों का उपयोग करके दूर से किया गया था।स्क्रीन पर छवि के बाईं ओर, आप हेड को पकड़े हुए वायर लूप और ईटी ट्यूब के अंदर स्थापित डिलीवरी कैनुला देख सकते हैं।
100 μl ग्लास सिरिंज का उपयोग करके एक रिमोट नियंत्रित सिरिंज पंप सिस्टम (UMP2, वर्ल्ड प्रिसिजन इंस्ट्रूमेंट्स, सारासोटा, FL) को 30 Ga सुई का उपयोग करके PE10 ट्यूबिंग (0.61 मिमी OD, 0.28 मिमी आईडी) से जोड़ा गया था।यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को चिह्नित करें कि एंडोट्रैचियल ट्यूब डालते समय टिप श्वासनली में सही स्थिति में है।एक माइक्रोपंप का उपयोग करके, सिरिंज प्लंजर को हटा दिया गया और ट्यूब की नोक को वितरित किए जाने वाले एमपी नमूने में डुबोया गया।भरी हुई डिलीवरी ट्यूब को फिर एंडोट्रैचियल ट्यूब में डाला गया, जिससे टिप हमारे अपेक्षित लागू चुंबकीय क्षेत्र के सबसे मजबूत हिस्से पर आ गई।छवि अधिग्रहण को हमारे Arduino-आधारित टाइमिंग बॉक्स से जुड़े एक सांस डिटेक्टर का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था, और सभी सिग्नल (जैसे, तापमान, श्वसन, शटर खुला / बंद, और छवि अधिग्रहण) पावरलैब और लैबचार्ट (एडी इंस्ट्रूमेंट्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए थे। 22 इमेजिंग करते समय जब आवास अनुपलब्ध था, तो दो आईपी कैमरे (पैनासोनिक बीबी-एससी382) एक दूसरे से लगभग 90° पर स्थित थे और इमेजिंग के दौरान श्वासनली के सापेक्ष चुंबक की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता था (चित्र 2बी, सी)।गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, टर्मिनल श्वसन प्रवाह पठार के दौरान प्रति सांस एक छवि प्राप्त की गई थी।
चुंबक दूसरे चरण से जुड़ा होता है, जो इमेजिंग बॉडी के बाहर दूर से स्थित हो सकता है।चुंबक की विभिन्न स्थितियों और विन्यासों का परीक्षण किया गया, जिनमें शामिल हैं: श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर रखा गया (विन्यास चित्र 2ए और 3ए में दिखाए गए हैं);एक चुंबक जानवर के ऊपर और दूसरा नीचे, जिसके ध्रुव आकर्षण के लिए निर्धारित हैं (चित्र 3बी)।, एक चुंबक जानवर के ऊपर और एक नीचे, प्रतिकर्षण के लिए निर्धारित ध्रुवों के साथ (चित्र 3सी), और एक चुंबक ऊपर और श्वासनली के लंबवत (चित्र 3डी)।जानवर और चुंबक को स्थापित करने और परीक्षण के तहत एमपी को सिरिंज पंप में लोड करने के बाद, छवियों के अधिग्रहण पर 4 μl/सेकंड की दर से 50 μl की खुराक दें।फिर छवियां प्राप्त करना जारी रखते हुए चुंबक को श्वासनली के साथ या उसके पार आगे और पीछे ले जाया जाता है।
विवो इमेजिंग के लिए चुंबक विन्यास (ए) लगभग 30 डिग्री के कोण पर श्वासनली के ऊपर एक चुंबक, (बी) आकर्षण के लिए कॉन्फ़िगर किए गए दो चुंबक, (सी) प्रतिकर्षण के लिए कॉन्फ़िगर किए गए दो चुंबक, (डी) ऊपर और लंबवत एक चुंबक श्वासनली.पर्यवेक्षक ने श्वासनली के माध्यम से मुंह से नीचे फेफड़ों तक देखा और एक्स-रे किरण चूहे के बाईं ओर से होकर दाईं ओर से बाहर निकल गई।चुंबक को या तो वायुमार्ग की लंबाई के साथ या एक्स-रे किरण की दिशा में श्वासनली के ऊपर बाएं और दाएं घुमाया जाता है।
हमने श्वसन और हृदय गति के मिश्रण के अभाव में वायुमार्ग में कणों की दृश्यता और व्यवहार को निर्धारित करने की भी कोशिश की।इसलिए, इमेजिंग अवधि के अंत में, जानवरों को पेंटोबार्बिटल ओवरडोज़ (सोम्नोपेंटाइल, पिटमैन-मूर, वाशिंगटन क्रॉसिंग, यूएसए; ~65 मिलीग्राम/किग्रा आईपी) के कारण मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई।कुछ जानवरों को इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म पर छोड़ दिया गया था, और सांस लेने और दिल की धड़कन बंद होने के बाद, इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराया गया था, अगर वायुमार्ग की सतह पर कोई एमपी दिखाई नहीं दे रहा था, तो एमपी की एक अतिरिक्त खुराक जोड़ दी गई थी।
परिणामी छवियों को समतल और अंधेरे क्षेत्र के लिए ठीक किया गया और फिर MATLAB (R2020a, द मैथवर्क्स) में लिखी एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करके एक मूवी (20 फ्रेम प्रति सेकंड; 15-25 × श्वसन दर के आधार पर सामान्य गति) में इकट्ठा किया गया।
एलवी जीन वेक्टर डिलीवरी पर सभी अध्ययन एडिलेड विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केंद्र में आयोजित किए गए थे और इसका उद्देश्य एसपीरिंग -8 प्रयोग के परिणामों का उपयोग करके यह आकलन करना था कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी डिलीवरी विवो में जीन स्थानांतरण को बढ़ा सकती है या नहीं। .एमएफ और चुंबकीय क्षेत्र के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, जानवरों के दो समूहों का इलाज किया गया: एक समूह को चुंबक प्लेसमेंट के साथ एलवी एमएफ के साथ इंजेक्ट किया गया था, और दूसरे समूह को चुंबक के बिना एलवी एमएफ के साथ एक नियंत्रण समूह के साथ इंजेक्ट किया गया था।
एलवी जीन वैक्टर पहले वर्णित विधियों 25, 26 का उपयोग करके उत्पन्न किए गए हैं।लैकज़ वेक्टर एमपीएसवी कांस्टीट्यूशनल प्रमोटर (एलवी-लाकज़) द्वारा संचालित एक परमाणु स्थानीयकृत बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ जीन को व्यक्त करता है, जो ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एक नीला प्रतिक्रिया उत्पाद पैदा करता है, जो फेफड़ों के ऊतकों के मोर्चों और वर्गों पर दिखाई देता है।टीयू/एमएल में टिटर की गणना करने के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके लैकज़-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनकर सेल संस्कृतियों में अनुमापन किया गया था।वाहकों को -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रिजर्व किया जाता है, उपयोग से पहले पिघलाया जाता है, और 1:1 को मिलाकर कॉम्बीमैग से बांधा जाता है और डिलीवरी से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाता है।
सामान्य स्प्रैग डावले चूहे (एन = 3/समूह, 1 महीने की उम्र में 0.4 मिलीग्राम/किग्रा मेडेटोमिडाइन (डोमिटर, इलियम, ऑस्ट्रेलिया) और 60 मिलीग्राम/किग्रा केटामाइन (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) के मिश्रण के साथ ~2-3 एनेस्थेटाइज्ड आईपी) आईपी ) 16 Ga अंतःशिरा प्रवेशनी के साथ इंजेक्शन और गैर-सर्जिकल मौखिक कैनुलेशन।यह सुनिश्चित करने के लिए कि श्वासनली वायुमार्ग ऊतक एलवी ट्रांसडक्शन प्राप्त करता है, इसे हमारे पहले वर्णित यांत्रिक गड़बड़ी प्रोटोकॉल का उपयोग करके वातानुकूलित किया गया था जिसमें श्वासनली वायुमार्ग की सतह को एक तार की टोकरी (एन-सर्कल, नाइटिनोल स्टोन एक्सट्रैक्टर बिना टिप एनटीएसई-022115) -यूडीएच के साथ अक्षीय रूप से रगड़ा गया था। कुक मेडिकल, यूएसए) 30 पी28।फिर, जैव सुरक्षा कैबिनेट में गड़बड़ी के लगभग 10 मिनट बाद, एलवी-एमपी का श्वासनली प्रशासन किया गया।
इस प्रयोग में उपयोग किए गए चुंबकीय क्षेत्र को इन विवो एक्स-रे अध्ययन के समान कॉन्फ़िगर किया गया था, जिसमें आसवन स्टेंट क्लैंप (चित्र 4) के साथ श्वासनली पर समान चुंबक रखे गए थे।जैसा कि पहले बताया गया है, जेल-टिप्ड पिपेट का उपयोग करके एलवी-एमपी की 50 μl मात्रा (2 x 25 μl एलिकोट्स) श्वासनली (एन = 3 जानवरों) तक पहुंचाई गई थी।नियंत्रण समूह (एन = 3 जानवरों) को चुंबक के उपयोग के बिना समान एलवी-एमपी प्राप्त हुआ।जलसेक पूरा होने के बाद, प्रवेशनी को एंडोट्रैचियल ट्यूब से हटा दिया जाता है और जानवर को बाहर निकाल दिया जाता है।चुंबक हटाए जाने से पहले 10 मिनट तक अपनी जगह पर बना रहता है।चूहों को चमड़े के नीचे मेलॉक्सिकैम (1 मिली/किग्रा) (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) की खुराक दी गई, इसके बाद 1 मिलीग्राम/किग्रा एटिपैमाजोल हाइड्रोक्लोराइड (एंटीसेडान, ज़ोएटिस, ऑस्ट्रेलिया) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थीसिया वापस लिया गया।चूहों को गर्म रखा गया और एनेस्थीसिया से पूरी तरह ठीक होने तक उन पर नजर रखी गई।
जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एलवी-एमपी डिलीवरी डिवाइस।आप देख सकते हैं कि ईटी ट्यूब की हल्के भूरे रंग की लुअर-लॉक आस्तीन मुंह से बाहर निकलती है, और चित्र में दिखाए गए जेल पिपेट टिप को ईटी ट्यूब के माध्यम से श्वासनली में वांछित गहराई तक डाला जाता है।
एलवी-एमपी प्रशासन प्रक्रिया के एक सप्ताह बाद, जानवरों को 100% CO2 की साँस द्वारा बलि दी गई और हमारे मानक एक्स-गैल उपचार का उपयोग करके लैकज़ अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया।यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंडोट्रैचियल ट्यूब प्लेसमेंट के कारण किसी भी यांत्रिक क्षति या द्रव प्रतिधारण को विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा, तीन सबसे दुम उपास्थि के छल्ले हटा दिए गए थे।विश्लेषण के लिए दो हिस्सों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक श्वासनली को लंबाई में काटा गया और ल्यूमिनल सतह की कल्पना करने के लिए मिनुटियन सुई (फाइन साइंस टूल्स) का उपयोग करके सिलिकॉन रबर (सिल्गार्ड, डॉव इंक) वाले कप में रखा गया।ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के वितरण और चरित्र की पुष्टि डिजीलाइट कैमरा और टीकैप्चर सॉफ्टवेयर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) के साथ निकॉन माइक्रोस्कोप (SMZ1500) का उपयोग करके फ्रंटल फोटोग्राफी द्वारा की गई थी।छवियों को 20x आवर्धन (श्वासनली की पूरी चौड़ाई के लिए अधिकतम सेटिंग सहित) पर प्राप्त किया गया था, श्वासनली की पूरी लंबाई को चरण दर चरण प्रदर्शित किया गया था, जिससे छवियों को "सिलाई" करने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक छवि के बीच पर्याप्त ओवरलैप प्रदान किया गया था।प्रत्येक श्वासनली से छवियों को प्लानर मोशन एल्गोरिदम का उपयोग करके समग्र छवि संपादक संस्करण 2.0.3 (माइक्रोसॉफ्ट रिसर्च) का उपयोग करके एक एकल समग्र छवि में जोड़ा गया था। प्रत्येक जानवर से श्वासनली मिश्रित छवियों के भीतर लैकज़ अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था, 0.35 <ह्यू <0.58, संतृप्ति> 0.15, और मान <0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके। प्रत्येक जानवर से श्वासनली मिश्रित छवियों के भीतर लैक्ज़ अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था, 0.35 <ह्यू <0.58, संतृप्ति> 0.15, और मान <0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके। Площадь экспресииK с с составных изображения ттж ही оматированного сценария MATLAB (R2020A, MathWorks), значение <0 ,7. प्रत्येक जानवर से समग्र श्वासनली छवियों में लैक्ज़ अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जैसा कि पहले वर्णित28 में 0.35 की सेटिंग्स का उपयोग करके बताया गया था।0.15 और मान<0 .7.अधिक पढ़ें उत्तर: 0.35% < 0.58% 0.15% 0.15% < 0.7% .और पढ़ें 0.35% 0.35 <0.58 、> 0.15 और 0.7% 0.7% 0.7% .................... कूल्हा Области экоресииK нZ на составных изображения трахеи каждого жи डालना рованного сценария matlab (R2020A, MathWorks), <0,7 . प्रत्येक जानवर के श्वासनली की मिश्रित छवियों पर लैकज़ अभिव्यक्ति के क्षेत्रों को एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले 0.35 <hue <0.58, संतृप्ति> 0.15 और मान <0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके वर्णित किया गया था।जीआईएमपी v2.10.24 में ऊतक आकृति को ट्रैक करके, ऊतक क्षेत्र की पहचान करने और श्वासनली ऊतक के बाहर किसी भी गलत पहचान को रोकने के लिए प्रत्येक समग्र छवि के लिए मैन्युअल रूप से एक मास्क बनाया गया था।प्रत्येक जानवर की सभी समग्र छवियों से दाग वाले क्षेत्रों को उस जानवर के लिए कुल दाग वाले क्षेत्र देने के लिए सारांशित किया गया था।सामान्यीकृत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए चित्रित क्षेत्र को मास्क के कुल क्षेत्र से विभाजित किया गया था।
प्रत्येक श्वासनली को पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था और 5 µm मोटा खंडित किया गया था।अनुभागों को 5 मिनट के लिए तटस्थ तेज़ लाल रंग से दाग दिया गया और छवियों को Nikon Eclipse E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 कैमरा और NIS तत्व कैप्चर सॉफ़्टवेयर (संस्करण 5.20.00) का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म v9 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक.) में किए गए थे।सांख्यिकीय महत्व p ≤ 0.05 पर निर्धारित किया गया था।शापिरो-विल्क परीक्षण का उपयोग करके सामान्यता का परीक्षण किया गया था और एक अयुग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके लैकज़ धुंधलापन में अंतर का मूल्यांकन किया गया था।
तालिका 1 में वर्णित छह एमपी की जांच पीसीएक्सआई द्वारा की गई थी, और दृश्यता तालिका 2 में वर्णित है। दो पॉलीस्टीरीन एमपी (एमपी1 और एमपी2; 18 µm और 0.25 µm, क्रमशः) पीसीएक्सआई द्वारा दिखाई नहीं दे रहे थे, लेकिन शेष नमूनों की पहचान की जा सकती थी (उदाहरण चित्र 5 में दिखाए गए हैं)।MP3 और MP4 कमजोर रूप से दिखाई देते हैं (क्रमशः 10-15% Fe3O4; 0.25 µm और 0.9 µm)।हालाँकि MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) में परीक्षण किए गए कुछ सबसे छोटे कण शामिल थे, यह सबसे अधिक स्पष्ट था।CombiMag MP6 उत्पाद को अलग करना कठिन है।सभी मामलों में, चुंबक को केशिका के समानांतर आगे और पीछे ले जाने से एमएफ का पता लगाने की हमारी क्षमता में काफी सुधार हुआ।जैसे-जैसे चुम्बक केशिका से दूर चले गए, कणों को लंबी श्रृंखलाओं में खींच लिया गया, लेकिन जैसे-जैसे चुम्बक पास आए और चुंबकीय क्षेत्र की ताकत बढ़ी, कण श्रृंखला छोटी हो गई क्योंकि कण केशिका की ऊपरी सतह की ओर चले गए (पूरक वीडियो S1 देखें) : MP4), सतह पर कण घनत्व को बढ़ाता है।इसके विपरीत, जब चुंबक को केशिका से हटा दिया जाता है, तो क्षेत्र की ताकत कम हो जाती है और एमपी केशिका की ऊपरी सतह से फैली हुई लंबी श्रृंखलाओं में पुनर्व्यवस्थित हो जाते हैं (पूरक वीडियो S2: MP4 देखें)।चुम्बक के हिलने-डुलने के बाद, कण संतुलन स्थिति में पहुँचने के बाद कुछ समय तक गति करते रहते हैं।जैसे-जैसे एमपी केशिका की ऊपरी सतह की ओर और दूर जाता है, चुंबकीय कण तरल के माध्यम से मलबे को खींचने लगते हैं।
पीसीएक्सआई के तहत एमपी की दृश्यता नमूनों के बीच काफी भिन्न होती है।(ए) एमपी3, (बी) एमपी4, (सी) एमपी5 और (डी) एमपी6।यहां दिखाई गई सभी छवियां केशिका से लगभग 10 मिमी सीधे ऊपर स्थित एक चुंबक से ली गई थीं।स्पष्ट बड़े वृत्त केशिकाओं में फंसे हवा के बुलबुले हैं, जो स्पष्ट रूप से चरण विपरीत छवि के काले और सफेद किनारे की विशेषताओं को दिखाते हैं।लाल बॉक्स आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ध्यान दें कि सभी आंकड़ों में चुंबक सर्किट के व्यास पैमाने के अनुसार नहीं हैं और दिखाए गए से लगभग 100 गुना बड़े हैं।
जैसे ही चुंबक केशिका के शीर्ष पर बाएं और दाएं चलता है, एमपी स्ट्रिंग का कोण चुंबक के साथ संरेखित होने के लिए बदल जाता है (चित्र 6 देखें), इस प्रकार चुंबकीय क्षेत्र रेखाओं का चित्रण होता है।एमपी3-5 के लिए, कॉर्ड थ्रेशोल्ड कोण तक पहुंचने के बाद, कण केशिका की ऊपरी सतह के साथ खिंचते हैं।इसके परिणामस्वरूप अक्सर सांसद बड़े समूहों में एकत्रित हो जाते हैं जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है (पूरक वीडियो S3: MP5 देखें)।केशिका के अंत के करीब इमेजिंग करते समय यह विशेष रूप से स्पष्ट होता है, जो एमपी को तरल-वायु इंटरफ़ेस पर एकत्रित और केंद्रित करने का कारण बनता है।एमपी6 में कण, जिन्हें एमपी3-5 की तुलना में अलग करना कठिन था, जब चुंबक केशिका के साथ चलता था तो वे खिंचते नहीं थे, लेकिन एमपी तार अलग हो जाते थे, जिससे कण दृश्य में रह जाते थे (पूरक वीडियो एस4: एमपी6 देखें)।कुछ मामलों में, जब चुंबक को इमेजिंग साइट से लंबी दूरी पर ले जाकर लागू चुंबकीय क्षेत्र को कम कर दिया गया, तो कोई भी शेष एमपी धीरे-धीरे गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब की निचली सतह पर उतर गया, स्ट्रिंग में शेष रह गया (पूरक वीडियो S5: MP3 देखें) .
जैसे ही चुंबक केशिका के ऊपर दाईं ओर जाता है, एमपी स्ट्रिंग का कोण बदल जाता है।(ए) एमपी3, (बी) एमपी4, (सी) एमपी5 और (डी) एमपी6।लाल बॉक्स आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।कृपया ध्यान दें कि अतिरिक्त वीडियो सूचनात्मक उद्देश्यों के लिए हैं क्योंकि वे महत्वपूर्ण कण संरचना और गतिशील जानकारी प्रकट करते हैं जिन्हें इन स्थिर छवियों में नहीं देखा जा सकता है।
हमारे परीक्षणों से पता चला है कि श्वासनली के साथ चुंबक को धीरे-धीरे आगे और पीछे ले जाने से विवो में जटिल आंदोलन के संदर्भ में एमएफ के दृश्य की सुविधा मिलती है।कोई इन विवो परीक्षण नहीं किया गया क्योंकि पॉलीस्टाइरीन मोती (एमपी1 और एमपी2) केशिका में दिखाई नहीं दे रहे थे।शेष चार एमएफ में से प्रत्येक का परीक्षण ऊर्ध्वाधर से लगभग 30° के कोण पर श्वासनली के ऊपर स्थित चुंबक की लंबी धुरी के साथ किया गया था (आंकड़े 2बी और 3ए देखें), क्योंकि इसके परिणामस्वरूप लंबी एमएफ श्रृंखलाएं बनीं और यह अधिक प्रभावी थी। एक चुंबक की तुलना में..कॉन्फ़िगरेशन समाप्त हो गया.किसी भी जीवित जानवर की श्वासनली में MP3, MP4 और MP6 नहीं पाए गए हैं।जानवरों को मानवीय तरीके से मारने के बाद चूहों के श्वसन पथ की कल्पना करते समय, सिरिंज पंप का उपयोग करके अतिरिक्त मात्रा जोड़ने पर भी कण अदृश्य रहे।एमपी5 में आयरन ऑक्साइड की मात्रा सबसे अधिक थी और यह एकमात्र दृश्यमान कण था, इसलिए इसका उपयोग विवो में एमपी व्यवहार का मूल्यांकन और लक्षण वर्णन करने के लिए किया गया था।
एमएफ सम्मिलन के दौरान श्वासनली के ऊपर चुंबक लगाने के परिणामस्वरूप कई, लेकिन सभी नहीं, एमएफ दृश्य के क्षेत्र में केंद्रित हो गए।कणों का श्वासनली प्रवेश मानवीय इच्छामृत्यु वाले जानवरों में सबसे अच्छा देखा जाता है।चित्र 7 और अनुपूरक वीडियो S6: MP5 उदर श्वासनली की सतह पर कणों के तेजी से चुंबकीय कैप्चर और संरेखण को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि सांसदों को श्वासनली के वांछित क्षेत्रों पर लक्षित किया जा सकता है।एमएफ डिलीवरी के बाद श्वासनली के साथ अधिक दूर तक खोज करने पर, कुछ एमएफ कैरिना के करीब पाए गए, जो सभी एमएफ को इकट्ठा करने और पकड़ने के लिए अपर्याप्त चुंबकीय क्षेत्र की ताकत को इंगित करता है, क्योंकि उन्हें द्रव प्रशासन के दौरान अधिकतम चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के क्षेत्र के माध्यम से वितरित किया गया था।प्रक्रिया।हालाँकि, प्रसवोत्तर एमपी सांद्रता छवि क्षेत्र के आसपास अधिक थी, जिससे पता चलता है कि कई एमपी वायुमार्ग क्षेत्रों में रहे जहां लागू चुंबकीय क्षेत्र की ताकत सबसे अधिक थी।
इमेजिंग क्षेत्र के ठीक ऊपर रखे गए चुंबक के साथ हाल ही में इच्छामृत्यु प्राप्त चूहे की श्वासनली में एमपी5 की डिलीवरी से पहले (ए) और (बी) के बाद की छवियां।चित्रित क्षेत्र दो कार्टिलाजिनस वलय के बीच स्थित है।सांसद के प्रसव से पहले वायुमार्ग में कुछ तरल पदार्थ है।लाल बॉक्स आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ये छवियाँ S6: MP5 अनुपूरक वीडियो में प्रदर्शित वीडियो से ली गई हैं।
विवो में श्वासनली के साथ चुंबक को ले जाने से वायुमार्ग की सतह पर एमपी श्रृंखला के कोण में बदलाव आया, जैसा कि केशिकाओं में देखा गया था (चित्रा 8 और पूरक वीडियो एस 7: एमपी 5 देखें)।हालाँकि, हमारे अध्ययन में, सांसदों को जीवित श्वसन पथ की सतह पर नहीं खींचा जा सका, जैसा कि केशिकाएँ कर सकती हैं।कुछ मामलों में, चुंबक के बाएँ और दाएँ घूमने पर MP श्रृंखला लंबी हो जाती है।दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी पाया कि जब चुंबक को श्वासनली के साथ अनुदैर्ध्य रूप से घुमाया जाता है तो कण श्रृंखला द्रव की सतह परत की गहराई को बदल देती है, और जब चुंबक को सीधे ऊपर की ओर ले जाया जाता है और कण श्रृंखला को ऊर्ध्वाधर स्थिति में घुमाया जाता है तो इसका विस्तार होता है (देखें) अनुपूरक वीडियो S7).: MP5 0:09 पर, नीचे दाएं)।जब चुंबक को श्वासनली के शीर्ष पर पार्श्व में ले जाया गया (यानी, श्वासनली की लंबाई के बजाय जानवर के बाईं या दाईं ओर) तो विशिष्ट गति पैटर्न बदल गया।कण अभी भी अपनी गति के दौरान स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, लेकिन जब चुंबक को श्वासनली से हटा दिया गया, तो कण तारों की युक्तियाँ दिखाई देने लगीं (पूरक वीडियो S8: MP5 देखें, 0:08 से शुरू)।यह कांच केशिका में लागू चुंबकीय क्षेत्र की कार्रवाई के तहत चुंबकीय क्षेत्र के देखे गए व्यवहार से सहमत है।
जीवित संवेदनाहारी चूहे की श्वासनली में MP5 दिखाने वाली नमूना छवियां।(ए) चुंबक का उपयोग श्वासनली के ऊपर और बाईं ओर की छवियां प्राप्त करने के लिए किया जाता है, फिर (बी) चुंबक को दाईं ओर ले जाने के बाद।लाल बॉक्स आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ये छवियाँ S7 के अनुपूरक वीडियो: MP5 में प्रदर्शित वीडियो से हैं।
जब दो ध्रुवों को श्वासनली के ऊपर और नीचे उत्तर-दक्षिण दिशा में ट्यून किया गया (यानी, आकर्षित करने वाला; चित्र 3 बी), तो एमपी तार लंबे दिखाई दिए और श्वासनली की पृष्ठीय सतह के बजाय श्वासनली की पार्श्व दीवार पर स्थित थे। श्वासनली (परिशिष्ट देखें)।वीडियो S9:MP5).हालाँकि, दोहरे चुंबक उपकरण का उपयोग करके द्रव प्रशासन के बाद एक साइट (यानी, श्वासनली की पृष्ठीय सतह) पर कणों की उच्च सांद्रता का पता नहीं लगाया गया था, जो आमतौर पर एकल चुंबक उपकरण के साथ होता है।फिर, जब एक चुंबक को विपरीत ध्रुवों को पीछे हटाने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया (चित्रा 3सी), तो डिलीवरी के बाद दृश्य क्षेत्र में दिखाई देने वाले कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।उच्च चुंबकीय क्षेत्र शक्ति के कारण दोनों चुंबक विन्यासों को स्थापित करना चुनौतीपूर्ण है जो चुंबकों को क्रमशः आकर्षित या धकेलता है।तब सेटअप को वायुमार्ग के समानांतर एक एकल चुंबक में बदल दिया गया था, लेकिन वायुमार्ग से 90 डिग्री के कोण पर गुजर रहा था ताकि बल की रेखाएं श्वासनली की दीवार को ऑर्थोगोनली (चित्रा 3 डी) से पार कर जाएं, एक अभिविन्यास का उद्देश्य कण एकत्रीकरण की संभावना निर्धारित करना था पार्श्व दीवार.परीक्षण में रहना।हालाँकि, इस कॉन्फ़िगरेशन में, कोई पहचानने योग्य एमएफ संचय गति या चुंबक गति नहीं थी।इन सभी परिणामों के आधार पर, जीन वाहकों के विवो अध्ययन के लिए एकल चुंबक और 30-डिग्री अभिविन्यास के साथ एक कॉन्फ़िगरेशन चुना गया था (चित्र 3 ए)।
जब पशु को मानवीय रूप से बलि दिए जाने के तुरंत बाद कई बार चित्रित किया गया था, तो हस्तक्षेप करने वाले ऊतक गति की अनुपस्थिति का मतलब था कि महीन, छोटी कण रेखाओं को स्पष्ट इंटरकार्टिलाजिनस क्षेत्र में देखा जा सकता था, जो चुंबक की अनुवादात्मक गति के अनुसार 'लहराती' थी।MP6 कणों की उपस्थिति और गति को स्पष्ट रूप से देखें।
LV-LacZ का अनुमापांक 1.8 x 108 IU/mL था, और कॉम्बीमैग MP (MP6) के साथ 1:1 मिश्रण करने के बाद, जानवरों को LV वाहन के 9 x 107 IU/ml की श्वासनली खुराक के 50 μl (यानी 4.5) के साथ इंजेक्ट किया गया था। x 106 टीयू/चूहा)।).).इन अध्ययनों में, प्रसव के दौरान चुंबक को हिलाने के बजाय, हमने यह निर्धारित करने के लिए चुंबक को एक स्थिति में स्थिर किया कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की अनुपस्थिति में वेक्टर डिलीवरी की तुलना में एलवी ट्रांसडक्शन में सुधार किया जा सकता है, और (बी) क्या वायुमार्ग में सुधार किया जा सकता है। ध्यान केंद्रित किया।कोशिकाओं को ऊपरी श्वसन पथ के चुंबकीय लक्ष्य क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जा रहा है।
मैग्नेट की उपस्थिति और एलवी वैक्टर के साथ संयोजन में कॉम्बीमैग के उपयोग से पशु स्वास्थ्य पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ता है, जैसा कि हमारे मानक एलवी वेक्टर डिलीवरी प्रोटोकॉल पर पड़ता है।यांत्रिक गड़बड़ी (पूरक छवि 1) के अधीन श्वासनली क्षेत्र की ललाट छवियों से पता चला है कि एलवी-एमपी उपचारित समूह में चुंबक की उपस्थिति में पारगमन का स्तर काफी अधिक था (छवि 9 ए)।नियंत्रण समूह में नीले लैक्ज़ धुंधलापन की केवल थोड़ी मात्रा मौजूद थी (चित्र 9बी)।एक्स-गैल-दाग वाले सामान्यीकृत क्षेत्रों की मात्रा का पता चला कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी के प्रशासन के परिणामस्वरूप लगभग 6 गुना सुधार हुआ (चित्र 9 सी)।
एलवी-एमपी (ए) के साथ चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में और (बी) चुंबक की अनुपस्थिति में श्वासनली पारगमन दिखाने वाली मिश्रित छवियों का उदाहरण।(सी) चुंबक के उपयोग से श्वासनली में लैक्ज़ पारगमन के सामान्यीकृत क्षेत्र में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सुधार (*पी = 0.029, टी-परीक्षण, एन = 3 प्रति समूह, माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि)।
तटस्थ तेज़ लाल-दाग वाले खंड (उदाहरण अनुपूरक चित्र 2 में दिखाया गया है) ने संकेत दिया कि लैकज़-दाग वाली कोशिकाएं एक ही नमूने में और उसी स्थान पर मौजूद थीं जैसा कि पहले बताया गया था।
वायुमार्ग जीन थेरेपी में मुख्य चुनौती रुचि के क्षेत्रों में वाहक कणों का सटीक स्थानीयकरण और वायुप्रवाह और सक्रिय बलगम निकासी की उपस्थिति में मोबाइल फेफड़े में उच्च स्तर की पारगमन दक्षता की उपलब्धि बनी हुई है।सिस्टिक फाइब्रोसिस में श्वसन रोगों के उपचार के लिए लक्षित एलवी वाहकों के लिए, प्रवाहकीय वायुमार्ग में वाहक कणों के निवास समय को बढ़ाना अब तक एक अप्राप्य लक्ष्य रहा है।जैसा कि कैस्टेलानी एट अल ने बताया है, पारगमन को बढ़ाने के लिए चुंबकीय क्षेत्र के उपयोग से अन्य जीन वितरण विधियों जैसे कि इलेक्ट्रोपोरेशन पर लाभ होता है क्योंकि यह सादगी, अर्थव्यवस्था, स्थानीय वितरण, बढ़ी हुई दक्षता और कम ऊष्मायन समय को जोड़ सकता है।और संभवतः वाहन10 की कम खुराक।हालाँकि, बाहरी चुंबकीय बलों के प्रभाव के तहत वायुमार्ग में चुंबकीय कणों के जमाव और व्यवहार का कभी भी वर्णन नहीं किया गया है, और वास्तव में बरकरार जीवित वायुमार्ग में जीन अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाने के लिए इस विधि की क्षमता का विवो में प्रदर्शन नहीं किया गया है।
पीसीएक्सआई सिंक्रोट्रॉन पर हमारे इन विट्रो प्रयोगों से पता चला कि एमपी पॉलीस्टाइनिन के अपवाद के साथ, हमारे द्वारा परीक्षण किए गए सभी कण, हमारे द्वारा उपयोग किए गए इमेजिंग सेटअप में दिखाई दे रहे थे।चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में, चुंबकीय क्षेत्र तार बनाते हैं, जिसकी लंबाई कणों के प्रकार और चुंबकीय क्षेत्र की ताकत (यानी, चुंबक की निकटता और गति) से संबंधित होती है।जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है, जिन तारों को हम देखते हैं वे तब बनते हैं जब प्रत्येक व्यक्तिगत कण चुम्बकित हो जाता है और अपने स्वयं के स्थानीय चुंबकीय क्षेत्र को प्रेरित करता है।ये अलग-अलग क्षेत्र अन्य कणों के आकर्षण और प्रतिकर्षण की स्थानीय ताकतों के कारण अन्य समान कणों को इकट्ठा करने और समूह स्ट्रिंग गति के साथ जुड़ने का कारण बनते हैं।
आरेख (ए, बी) द्रव से भरी केशिकाओं के अंदर बनने वाले कणों की श्रृंखला और (सी, डी) हवा से भरी श्वासनली को दर्शाता है।ध्यान दें कि केशिकाएं और श्वासनली पैमाने पर नहीं खींची जाती हैं।पैनल (ए) में श्रृंखलाओं में व्यवस्थित Fe3O4 कणों वाले एमएफ का विवरण भी शामिल है।
जब चुंबक केशिका के ऊपर चला गया, तो कण स्ट्रिंग का कोण Fe3O4 युक्त MP3-5 के लिए महत्वपूर्ण सीमा तक पहुंच गया, जिसके बाद कण स्ट्रिंग अब अपनी मूल स्थिति में नहीं रही, बल्कि सतह के साथ एक नई स्थिति में चली गई।चुंबक.यह प्रभाव संभवतः इसलिए होता है क्योंकि कांच केशिका की सतह इस गति को घटित करने के लिए पर्याप्त चिकनी होती है।दिलचस्प बात यह है कि MP6 (कॉम्बीमैग) ने इस तरह से व्यवहार नहीं किया, शायद इसलिए क्योंकि कण छोटे थे, उनकी कोटिंग या सतह चार्ज अलग था, या मालिकाना वाहक द्रव ने उनकी गति करने की क्षमता को प्रभावित किया था।कॉम्बीमैग कण छवि में कंट्रास्ट भी कमजोर है, जिससे पता चलता है कि तरल और कणों का घनत्व समान हो सकता है और इसलिए वे आसानी से एक दूसरे की ओर नहीं बढ़ सकते हैं।यदि चुंबक बहुत तेजी से चलता है तो कण भी फंस सकते हैं, यह दर्शाता है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत हमेशा तरल पदार्थ में कणों के बीच घर्षण को दूर नहीं कर सकती है, यह सुझाव देता है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और चुंबक और लक्ष्य क्षेत्र के बीच की दूरी एक के रूप में नहीं आनी चाहिए। आश्चर्य।महत्वपूर्ण।इन परिणामों से यह भी संकेत मिलता है कि यद्यपि चुम्बक लक्ष्य क्षेत्र से बहने वाले कई सूक्ष्म कणों को पकड़ सकते हैं, लेकिन यह संभावना नहीं है कि श्वासनली की सतह के साथ कॉम्बीमैग कणों को स्थानांतरित करने के लिए चुम्बक पर भरोसा किया जा सकता है।इस प्रकार, हमने निष्कर्ष निकाला कि विवो एलवी एमएफ अध्ययन में वायुमार्ग वृक्ष के विशिष्ट क्षेत्रों को भौतिक रूप से लक्षित करने के लिए स्थैतिक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करना चाहिए।
एक बार जब कण शरीर में पहुंचा दिए जाते हैं, तो उन्हें शरीर के जटिल गतिमान ऊतकों के संदर्भ में पहचानना मुश्किल होता है, लेकिन एमपी स्ट्रिंग्स को "विगल" करने के लिए श्वासनली के ऊपर क्षैतिज रूप से चुंबक को घुमाकर उनकी पहचान क्षमता में सुधार किया गया है।जबकि वास्तविक समय की इमेजिंग संभव है, जानवर को मानवीय रूप से मारे जाने के बाद कणों की गति को समझना आसान है।जब चुंबक को इमेजिंग क्षेत्र के ऊपर रखा गया था तो एमपी सांद्रता आमतौर पर इस स्थान पर सबसे अधिक थी, हालांकि कुछ कण आमतौर पर श्वासनली के नीचे पाए जाते थे।इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, चुंबक की गति से कणों को श्वासनली से नीचे नहीं खींचा जा सकता है।यह खोज इस बात के अनुरूप है कि श्वासनली की सतह को कवर करने वाला बलगम आम तौर पर साँस के कणों को कैसे संसाधित करता है, उन्हें बलगम में फंसाता है और बाद में उन्हें म्यूको-सिलिरी क्लीयरेंस तंत्र के माध्यम से साफ करता है।
हमने अनुमान लगाया कि आकर्षण के लिए श्वासनली के ऊपर और नीचे चुम्बकों का उपयोग करने से (चित्र 3 बी) एक बिंदु पर अत्यधिक केंद्रित चुंबकीय क्षेत्र के बजाय अधिक समान चुंबकीय क्षेत्र हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित रूप से कणों का अधिक समान वितरण हो सकता है।.हालाँकि, हमारे प्रारंभिक अध्ययन में इस परिकल्पना का समर्थन करने के लिए स्पष्ट सबूत नहीं मिले।इसी प्रकार, चुम्बकों की एक जोड़ी को प्रतिकर्षण के लिए सेट करने से (चित्र 3सी) छवि क्षेत्र में अधिक कण जमा नहीं हुए।इन दो निष्कर्षों से पता चलता है कि दोहरी-चुंबक सेटअप एमपी पॉइंटिंग के स्थानीय नियंत्रण में उल्लेखनीय सुधार नहीं करता है, और परिणामस्वरूप मजबूत चुंबकीय बलों को ट्यून करना मुश्किल होता है, जिससे यह दृष्टिकोण कम व्यावहारिक हो जाता है।इसी प्रकार, श्वासनली के ऊपर और पार चुंबक को उन्मुख करने से भी छवि क्षेत्र में शेष कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।इनमें से कुछ वैकल्पिक विन्यास सफल नहीं हो सकते हैं क्योंकि उनके परिणामस्वरूप जमाव क्षेत्र में चुंबकीय क्षेत्र की ताकत में कमी आती है।इस प्रकार, 30 डिग्री पर एकल चुंबक विन्यास (चित्र 3ए) को विवो परीक्षण विधि में सबसे सरल और सबसे कुशल माना जाता है।
एलवी-एमपी अध्ययन से पता चला है कि जब एलवी वैक्टर को कॉम्बीमैग के साथ जोड़ा गया था और चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में शारीरिक रूप से परेशान होने के बाद वितरित किया गया था, तो नियंत्रण की तुलना में श्वासनली में पारगमन का स्तर काफी बढ़ गया था।सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अध्ययन और लैकज़ परिणामों के आधार पर, चुंबकीय क्षेत्र एलवी को श्वासनली में रखने और वेक्टर कणों की संख्या को कम करने में सक्षम प्रतीत होता है जो तुरंत फेफड़ों में गहराई से प्रवेश करते हैं।इस तरह के लक्ष्यीकरण सुधार से वितरित टाइटर्स, गैर-लक्षित ट्रांसडक्शन, सूजन और प्रतिरक्षा दुष्प्रभावों और जीन स्थानांतरण लागत को कम करते हुए उच्च दक्षता प्राप्त हो सकती है।महत्वपूर्ण रूप से, निर्माता के अनुसार, कॉम्बीमैग का उपयोग अन्य वायरल वैक्टर (जैसे एएवी) और न्यूक्लिक एसिड सहित अन्य जीन स्थानांतरण विधियों के साथ संयोजन में किया जा सकता है।