जिआर्डिया डुओडेनम एक परजीवी जीव है जो जिआर्डियासिस का कारण बनता है, एक आंतों का संक्रमण विशेष रूप से दस्त के नैदानिक ​​लक्षणों वाले छोटे बच्चों में आम है।हमने पहले बताया है कि बाह्य कोशिकीय जी. डुओडेनलिस इंट्रासेल्युलर ऑलिगोमेराइजेशन-जैसे रिसेप्टर 3 (एनएलआरपी 3) बाइंडिंग न्यूक्लियोटाइड के सक्रियण को ट्रिगर करता है और बाह्य कोशिकीय पुटिका (ईवी) स्राव के माध्यम से मेजबान सूजन प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है।हालाँकि, इस प्रक्रिया में शामिल रोगज़नक़ से जुड़े डुओडेनोकोकल ईवी (जीईवी) के सटीक आणविक पैटर्न और जिआर्डियासिस में एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका को स्पष्ट किया जाना बाकी है।
पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीसीडीएनए3.1(+)-जीईवी में अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन का निर्माण किया गया, माउस प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, और सूजन लक्ष्य अणु कैस्पेज़-1 को मापकर पता लगाया गया।P20 अभिव्यक्ति स्तर की जांच की गई।.जी. डुओडेनलिस अल्फ़ा-2 और अल्फ़ा-7.3 जिआर्डाइन की पहचान मूल रूप से एनएलआरपी3 इन्फ़्लैमसोम (एनएलआरपी3, प्रो-इंटरल्यूकिन-1 बीटा [आईएल-1β], प्रो-कैस्पेज़-1 और कैस्पेज़-1 पी20), आईएल स्राव को मापकर की गई थी।1β स्तर, एपोप्टोटिक स्पॉटेड प्रोटीन (एएससी) ऑलिगोमेराइजेशन स्तर, और एनएलआरपी3 और एएससी का इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्थानीयकरण।जी डुओडेनलिस की रोगजनकता में एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका का मूल्यांकन तब चूहों का उपयोग करके किया गया था जिसमें एनएलआरपी 3 सक्रियण अवरुद्ध था (एनएलआरपी 3 अवरुद्ध चूहों) और शरीर के वजन, ग्रहणी परजीवी भार और ग्रहणी ऊतक में रोग संबंधी परिवर्तनों की निगरानी की गई थी।इसके अलावा, हमने जांच की कि क्या हिआर्डाइन्स अल्फा-2 और अल्फा-7.3 एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के माध्यम से विवो में आईएल-1बीटा स्राव को प्रेरित करते हैं और चूहों में जी. डुओडेनलिस की रोगजनकता में इन अणुओं की भूमिका निर्धारित की है।
अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन इन विट्रो में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के सक्रियण को प्रेरित करते हैं।इससे पी20 कैस्पेज़-1 सक्रिय हो गया, एनएलआरपी3, प्रो-आईएल-1β और प्रो-कैस्पेज़-1 प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि हुई, आईएल-1β स्राव में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, एएसए स्पॉट का निर्माण हुआ। साइटोप्लाज्म, और एएसए ऑलिगोमेराइजेशन का प्रेरण।एनएलआरपी3 सूजन शिश्न की हानि चूहों में जी. डुओडेनलिस की रोगजनन क्षमता को बढ़ा देती है।एनएलआरपी 3-अवरुद्ध चूहों से गैवेज द्वारा सिस्ट का इलाज करने वाले चूहों में ट्रोफोज़ोइट्स की बढ़ी हुई संख्या और ग्रहणी विली को गंभीर क्षति देखी गई, जिसमें सिकुड़न और शाखाओं के साथ नेक्रोटिक क्रिप्ट की विशेषता थी।विवो प्रयोगों से पता चला है कि जिआर्डिन अल्फा-2 और अल्फा-7.3 एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के माध्यम से आईएल-1β के स्राव को प्रेरित कर सकते हैं, और जिआर्डिन अल्फा-2 और अल्फा-7.3 के साथ टीकाकरण से चूहों में जी. डुओडेनलिस की रोगजनकता कम हो गई है।
एक साथ लेने पर, इस अध्ययन के नतीजे बताते हैं कि जिआर्डिया अल्फा-2 और अल्फा-7.3 मेजबान एनएलआरपी3 सूजन के विनियमन का कारण बनते हैं और चूहों में जी. डुओडेनलिस की संक्रामकता को कम करते हैं, जो जिआर्डियासिस को रोकने के लिए आशाजनक लक्ष्य हैं।
जिआर्डिया डुओडेनम एक बाह्य कोशिकीय प्रोटोजोआ परजीवी है जो छोटी आंत में रहता है और सालाना दस्त के साथ जिआर्डियासिस के 280 मिलियन मामलों का कारण बनता है, खासकर विकासशील देशों में छोटे बच्चों में [1]।लोग एम. डुओडेनम सिस्ट से दूषित पानी या भोजन पीने से संक्रमित हो जाते हैं, जो बाद में पेट में प्रवेश करते हैं और गैस्ट्रिक रस में उत्सर्जित होते हैं।जिआर्डिया डुओडेनम ट्रोफोज़ोइट्स ग्रहणी उपकला से जुड़ जाते हैं, जिससे मतली, उल्टी, दस्त, पेट में दर्द और वजन कम होता है।इम्युनोडेफिशिएंसी और सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले व्यक्ति संक्रमण के प्रति संवेदनशील होते हैं।मौखिक और गुदा मैथुन के माध्यम से भी संक्रमण हो सकता है [2]।मेट्रोनिडाज़ोल, टिनिडाज़ोल और नाइटाज़ॉक्सानाइड जैसी दवाएं ग्रहणी संक्रमण के लिए पसंदीदा उपचार विकल्प हैं [3]।हालाँकि, ये कीमोथेरेपी दवाएं मतली, कार्सिनोजेनेसिस और जीनोटॉक्सिसिटी जैसे प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा करती हैं [4]।इसलिए, जी. डुओडेनलिस संक्रमण को रोकने के लिए अधिक प्रभावी रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है।
इन्फ्लैमासोम्स साइटोसोलिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का एक वर्ग है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का हिस्सा है, जो रोगज़नक़ आक्रमण से बचाव करने और सूजन प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करने में मदद करता है [5]।इन इनफ्लेमसोम में, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेराइजेशन (एनओडी) रिसेप्टर 3 (एनएलआरपी3) न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेराइजेशन (एनएलआरपी3) न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग-जैसे इनफ्लेमसोम का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि इसका पता विभिन्न रोगज़नक़/क्षति-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी/) द्वारा लगाया जा सकता है। DAMP), जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली को पहचानता है, सक्रिय करता है।और कई सूजन संबंधी बीमारियों में आंतों के होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है [6,7,8]।इसमें पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर (पीआरआर) एनएलआरपी3, एक एडेप्टर एपोप्टोटिक स्पॉटेड प्रोटीन (एएससी), और एक इफ़ेक्टर प्रोकास्पेज़-1 या प्रोकास्पेज़-11 शामिल है।एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम रोगज़नक़ आक्रमण के खिलाफ एक मेजबान के रूप में कार्य करता है, जैसा कि नियोस्पोरा कैनिनम [9], पैराकोकिडियोइड्स ब्रासिलिएन्सिस [10] और लीशमैनिया अध्ययन में देखा गया है।[11], लेकिन यह भी बताया गया है कि एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की सक्रियता सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सीमित करती है और रोग की प्रगति को बढ़ा देती है, उदाहरण के लिए, कृमियों में [12]।हमारे पिछले निष्कर्षों के आधार पर, हमने बताया कि बाह्यकोशिकीय जी. डुओडेनलिस एनएलआरपी3 सूजन के इंट्रासेल्युलर सक्रियण को ट्रिगर करता है और बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं (ईवीएस) को स्रावित करके मेजबान सूजन प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है [13]।हालाँकि, विवो में जी. डुओडेनलिस संक्रमण में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका निर्धारित की जानी बाकी है।
जिआर्डिन को मूल रूप से जी डुओडेनलिस साइटोस्केलेटन के संरचनात्मक घटकों के रूप में वर्णित किया गया था और छोटी आंत में ट्रोफोज़ोइट गतिशीलता और उपकला कोशिका लगाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।पर्यावरण के लिए बेहतर अनुकूलन और उनकी रोगजनकता को बढ़ाने के लिए, जी. डुओडेनलिस ट्रोफोज़ोइट्स ने एक अद्वितीय साइटोस्केलेटल संरचना विकसित की जिसमें 8 फ्लैगेला, 1 मध्य शरीर और 1 वेंट्रल डिस्क [14] शामिल थी।जिआर्डिया डुओडेनम के ट्रोफोज़ोइट्स अपने साइटोस्केलेटन का उपयोग ऊपरी छोटी आंत, विशेष रूप से डुओडेनम में प्रवेश करने और एंटरोसाइट्स से जुड़ने के लिए करते हैं।वे लगातार प्रवास करते हैं और कोशिका चयापचय का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं से जुड़ जाते हैं।इसलिए, उनके साइटोस्केलेटन और विषाणु के बीच घनिष्ठ संबंध है।जिआर्डिया डुओडेनम के लिए विशिष्ट जिआर्डिन साइटोस्केलेटन संरचना के घटक हैं [15] और इन्हें चार वर्गों में विभाजित किया गया है: α-, β-, γ-, और δ-जिआर्डिन।α-जिआर्डिन परिवार के 21 सदस्य हैं, जिनमें से सभी में फॉस्फोलिपिड्स को बांधने की कैल्शियम-निर्भर क्षमता होती है [16]।वे साइटोस्केलेटन को कोशिका झिल्ली से भी जोड़ते हैं।जी. डुओडेनैलिस के कारण होने वाले दस्त से पीड़ित व्यक्तियों में, संक्रमण के दौरान α-giardins अत्यधिक अभिव्यक्त और प्रतिरक्षी सक्रिय होते हैं [17]।जिआर्डिया अल्फ़ा-1 पर आधारित हेटेरोलॉगस टीके चूहों में जिआर्डियासिस से बचाव करते हैं और टीके के विकास के लिए संभावित उम्मीदवार एंटीजन हैं [18]।अल्फा-8 जिआर्डिन, प्लाज्मा झिल्ली और फ्लैगेल्ला में स्थानीयकृत है, लेकिन उदर डिस्क में नहीं, जी डुओडेनलिस में ट्रोफोज़ोइट्स की गतिशीलता और वृद्धि दर को बढ़ाता है [19]।अल्फा-14 जिआर्डिन फ्लैगेल्ला पर सूक्ष्मनलिका संरचनाओं से जुड़ जाता है और जी. डुओडेनलिस [20] की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है।अल्फा-11 जिआर्डिन पूरे जीवन चक्र में प्रचुर मात्रा में मौजूद होता है, और अल्फा-11 जिआर्डिन की अधिकता जी. डुओडेनलिस को ही नुकसान पहुंचाती है [21]।हालाँकि, यह स्पष्ट नहीं है कि अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा-7.3 जिआर्डिन जी. डुओडेनलिस संक्रमण और उनके अंतर्निहित तंत्र के खिलाफ सुरक्षात्मक हैं या नहीं।
इस अध्ययन में, मेजबान एनएलआरपी3 को सक्रिय करने के लिए पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जियार्डिन और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जियार्डिन को माउस प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था।फिर सूजन संबंधी लक्ष्यों की जांच की गई।हमने जी. डुओडेनैलिस की रोगजनन क्षमता में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका का भी आकलन किया, जांच की कि क्या अल्फा-2 और अल्फा-7,3 जियार्डिन विवो में एनएलआरपी3 इनफ्लेमसोम की सक्रियता को प्रेरित करते हैं, और यह निर्धारित किया कि जीआर्डिन की ये दो भूमिकाएं जी. डुओडेनलिस की रोगजनन क्षमता में हैं। जी डुओडेनैलिस।हमारा सामान्य लक्ष्य जी. डुओडेनलिस संक्रमण की रोकथाम के लिए आशाजनक लक्ष्य विकसित करना था।
5-8 सप्ताह की उम्र की जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) सी57बीएल/6 मादा चूहों को लियाओनिंग चांगशेंग प्रायोगिक पशु केंद्र (लियाओनिंग, चीन) से खरीदा गया था।चूहों को पानी तक मुफ्त पहुंच थी, उन्हें निष्फल भोजन मिलता था और उन्हें 12/12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखा जाता था।संक्रमण से पहले, चूहों को एम्पीसिलीन (1 मिलीग्राम/एमएल), वैनकोमाइसिन (1 मिलीग्राम/एमएल), और नियोमाइसिन (1.4 मिलीग्राम/एमएल) (सभी शंघाई, चीन, कृत्रिम जीवों से खरीदे गए) के साथ पीने के पानी में एड लिबिटम एंटीबायोटिक्स दिए गए थे [ 22 ].].जिन चूहों ने 24 घंटे से अधिक समय तक खाने-पीने की क्षमता खो दी और ≥ 20% शरीर का वजन खो दिया, उन्हें गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था के कारण मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई।
डब्ल्यूबी जी डुओडेनलिस ट्रोफोज़ोइट्स (अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन, मानस, यूएसए) को 12.5% ​​​​भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; हर ग्रीन, झेजियांग, चीन) और 0.1% गोजातीय पित्त (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट मिसौरी, यूएसए) के साथ पूरक किया गया था। ).यूएसए) माइक्रोएरोबिक परिस्थितियों में।संगम ट्रोफोज़ोइट्स को बर्फ पर एकत्र किया गया और आगे प्रजनन के लिए 1: 4 के अनुपात में पारित किया गया।
जिआर्डिया डुओडेनम सिस्ट को पहले वर्णित के अनुसार प्रेरित किया गया था [23], ट्रोफोज़ोइट्स को लॉगरिदमिक चरण में काटा गया था और फिर 1 × 106 ट्रोफोज़ोइट्स/एमएल की अंतिम सांद्रता तक इनकैप्सुलेशन उत्प्रेरण माध्यम, पीएच 7.1 (संशोधित टीवाईआई-एस-33) के साथ पतला किया गया था।पित्त सांद्रता 0.05% मध्यम)।लॉगरिदमिक विकास चरण तक ट्रोफोज़ोइट्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर अवायवीय परिस्थितियों में संवर्धित किया गया था।माध्यम को सिस्ट उत्प्रेरण माध्यम (पीएच 7.8; 1% पित्त सांद्रता के साथ संशोधित टीवाईआई-एस-33 माध्यम) में बदलें और 48-96 घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर जी. डुओडेनलिस, जिसके दौरान गठन सिस्ट को माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था।अधिकांश ट्रोफोज़ोइट्स को सिस्ट बनाने के लिए प्रेरित करने के बाद, शेष ट्रोफोज़ोइट्स को नष्ट करने के लिए कल्चर मिश्रण को काटा गया और बाँझ विआयनीकृत पानी में फिर से निलंबित कर दिया गया।चूहों में गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से बाद के विश्लेषण के लिए सिस्ट की गिनती की गई और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।
जिआर्डिया एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स (जीईवी) को पहले बताए अनुसार समृद्ध किया गया था [13]।लॉगरिदमिक विकास चरण में ट्रोफोज़ोइट्स को एक्सोसोम-क्षीण एफबीएस (जैविक उद्योग, बीट-हैमेक, इज़राइल) के साथ तैयार संशोधित टीवाईआई-एस-33 माध्यम में 1 × 106 परजीवियों/एमएल की अंतिम सांद्रता तक पुन: निलंबित किया गया और 12 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया।10 मिनट के लिए 2000 ग्राम, 45 मिनट के लिए 10,000 ग्राम और 60 मिनट के लिए 100,000 ग्राम को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से अलग किया गया।अवक्षेपों को फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में घोल दिया गया, बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया या आगे के विश्लेषण के लिए सीधे उपयोग किया गया।
प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज पहले बताए अनुसार तैयार किए गए थे [24]।संक्षेप में, चूहों (6-8 सप्ताह की आयु) को 2.98% डिफ्को तरल थियोग्लाइकोल माध्यम (बीडी, फ्रैंकलिन लेक, एनजे, यूएसए) के 2.5 मिलीलीटर के साथ इंजेक्शन (इंट्रापेरिटोनियल [आईपी]) दिया गया और 3-4 तालु खिलाया गया।इच्छामृत्यु के बाद चूहों की उदर गुहा से मैक्रोफेज का एक निलंबन एकत्र किया गया और 10 मिनट के लिए 1000 ग्राम पर 3 बार सेंट्रीफ्यूज किया गया।कोशिका की शुद्धता>98% होने तक सीडी11बी मार्कर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकत्रित कोशिकाओं का पता लगाया गया, फिर 6-वेल सेल कल्चर प्लेट्स (4.5 x 106 सेल/वेल) में जोड़ा गया और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस (बायोइंडस्ट्री) के साथ इनक्यूबेट किया गया।और 5% CO2.
ट्राईज़ोल अभिकर्मक (वेज़ाइम, नानजिंग, चीन) के 1 मिलीलीटर में 1 × 107 ट्रोफोज़ोइट्स से आरएनए निकाला गया था, मोनस्क्रिप्ट डीएसडीनेज़ (मोनैड, वुहान, चीन) का उपयोग करके कुल जी डुओडेनलिस आरएनए से जीनोमिक डीएनए निकाला गया था और पूरक डीएनए (सीडीएनए) को संश्लेषित किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार मॉनस्क्रिप्ट आरटीआईIII सुपर मिक्स (मोनैड) का उपयोग करना।
लक्ष्य जी. डुओडेनलिस जीन के लिए सीडीएस अनुक्रम जानकारी एनसीबीआई जेनबैंक से प्राप्त की गई थी।प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए विशिष्ट निर्बाध क्लोनिंग प्राइमर डिज़ाइन करने के लिए प्राइमर 5.0 का उपयोग करें।फॉरवर्ड प्राइमर (5′-3′) में तीन भाग होते हैं: एक रेखीयकृत वेक्टर PCDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) के साथ एक ओवरलैपिंग अनुक्रम और शुरुआती कोडन ATG और GNN (यदि पहला आधार G नहीं है)।यह अभिव्यक्ति की दक्षता में सुधार के लिए किया जाता है।इसके अलावा, कम से कम 16 बीपी संयुक्त आधार (जीसी सामग्री 40-60%/टीएम लगभग 55 डिग्री सेल्सियस)।रिवर्स प्राइमर (5′-3′) में दो भाग होते हैं, एक EcoRV-रैखिक वेक्टर PCDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) के साथ एक ओवरलैपिंग अनुक्रम और कम से कम 16 bp का संयुक्त आधार।(अंतिम दो पड़ावों को छोड़कर)।आधार) पुनः संयोजक प्लास्मिड को उनके लेबल वाले प्रोटीन को व्यक्त करने की अनुमति देने के लिए एए या जीए जैसे कोडन)।प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं और कांगमेट बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (चांगचुन, चीन) द्वारा संश्लेषित किए गए थे।
एक टेम्पलेट के रूप में तैयार जी. डुओडेनलिस सीडीएनए का उपयोग करके पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ (तियांगेन, बीजिंग, चीन) या एक्स-टैक (टकारा बायोमेडिकल टेक्नोलॉजी [बीजिंग] कं, लिमिटेड, बीजिंग, चीन) का उपयोग करके लक्ष्य को बढ़ाया गया था।यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वेक्टर प्लास्मिड PCDNA3.1(+) को प्रतिबंध एंजाइम इकोआरवी के साथ रैखिककृत किया गया था और फास्ट एपी (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके डीफॉस्फोराइलेट किया गया था।रैखिककृत PCDNA3.1(+) टुकड़े और प्रवर्धित लक्ष्य जीन टुकड़े को डीएनए जेल शुद्धि किट (तियांगेन) का उपयोग करके शुद्ध किया गया और नैनोड्रॉप एनडी-2000 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई।PCDNA3.1(+) टुकड़े और प्रत्येक लक्ष्य जीन टुकड़े को मोनक्लोन सिंगल असेंबली क्लोनिंग मिक्स (मोनाड बायोटेक कंपनी लिमिटेड, सूज़ौ, चीन) का उपयोग करके पुन: संयोजित किया गया और कॉमेट बायोसाइंस कंपनी लिमिटेड (चांगचुन, चीन) का उपयोग करके डीएनए अनुक्रमण द्वारा इसकी पुष्टि की गई।.
एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 और PCDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 सैनप्रेप एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लास्मिड मिनी किट (सैंगॉन बायोटेक) का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।यह सुनिश्चित करने के लिए एकाग्रता 500 एनजी/μl से ऊपर बनाए रखी गई थी कि रेफरेंस बफर में ईडीटीए ट्रांसफेक्शन परख में हस्तक्षेप नहीं करता है।प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज को 12 घंटे के लिए पूर्ण आरपीएमआई 1640 माध्यम (जैविक उद्योग) के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था, फिर कोशिकाओं को पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन को हटाने के लिए गर्म पीबीएस में 3 बार धोया गया था, और फिर मध्यम में पूर्ण माध्यम के साथ पूरक किया गया था।एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 और PCDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 (2.5 μg) को ऑप्टी-एमईएम कम सीरम माध्यम (गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के 125 μl में पतला किया गया था।.फिर लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक (इन्विट्रोजन, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के 5 μl को कम सीरम ऑप्टी-एमईएम माध्यम के 125 μl में पतला किया गया था।पतला एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड को लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 के साथ मिलाकर लिपोसोम-डीएनए कॉम्प्लेक्स तैयार करें और मिश्रण को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें।प्रत्येक कुएं में कॉम्प्लेक्स को अलग-अलग कोशिकाओं में स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे मिलाएं।4 घंटे के बाद, सेल कल्चर मीडियम को पूर्ण आरपीएमआई 1640 मीडियम के 2 मिलीलीटर से बदल दिया गया और कल्चर 24 घंटे तक जारी रखा गया।ताजा सेल कल्चर माध्यम को कोशिकाओं में जोड़ा गया और परख डिजाइन के आधार पर विभिन्न समय बिंदुओं के लिए इनक्यूबेट किया गया।
सतह पर तैरनेवाला और सेल लाइसेट्स से प्रोटीन के नमूने पहले बताए अनुसार तैयार किए गए थे [25]।प्रो-आईएल-1β, प्रो-कैस्पेज़-1, कैस्पेज़-1 पी20, एनएलआरपी3, β-एक्टिन और हिज-टैग के लिए झिल्ली स्थानांतरण पैरामीटर 200 एमए/90 मिनट थे।इंटरल्यूकिन 1β (IL-1β; R&D सिस्टम्स, मिनियापोलिस, मिनेसोटा, यूएसए), कैस्पेज़-1 (p20) (Adipogen, स्विट्जरलैंड) और NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, स्विट्जरलैंड) और 1:5000 के लिए उनके टैग को लक्षित करना (एमाइलेट साइंटिफिक, वुहान, चीन) और β-एक्टिन (प्रोटीनटेक, वुहान, चीन)।
जैसा कि पहले बताया गया है [26] डिसुसिनिमाइड सबरेट (डीएसएस) के साथ क्रॉस-लिंकिंग की गई थी।कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया और 25 मिमी Na2PO4, 187.5 मिमी NaCl, 25 मिमी HEPES और 125 मिमी NaHCO3 युक्त 50 μl ASC प्रतिक्रिया बफर (पीएच 8.0) में 27 गेज सुई के साथ पूरी तरह से लीज किया गया।मिश्रण को 3 मिनट के लिए 5000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था और गोली को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10 μl डीएसएस (डीएमएसओ में 25 मिमी) और 40 μl एएससी प्रतिक्रिया बफर के साथ सिल दिया गया था।10 मिनट के लिए 5000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गोली को एएससी प्रतिक्रिया बफर के 40 μl और 6x प्रोटीन लोडिंग बफर (ट्रांसजेन, बीजिंग, चीन) के 10 μl के समाधान में भंग कर दिया गया था, और फिर समाधान को 15 के लिए कमरे के तापमान पर बुझाया गया था। मि., फिर 10 मिनट तक उबालें।फिर प्रोटीन के नमूनों को 1:500 के कमजोर अनुपात पर प्राथमिक एंटी-एएससी एंटीबॉडी (वानलीबियो, शेनयांग, चीन) का उपयोग करके वेस्टर्न ब्लॉटिंग के अधीन किया गया।
पहले वर्णित प्रक्रिया [13] के बाद, सेल कल्चर सुपरनैटेंट्स की कटाई की गई और माउस आईएल-1 बीटा एलिसा किट (इनविट्रोजन, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन आईएल-1β का स्राव निर्धारित किया गया।IL-1β मानक वक्र का उपयोग करके OD450nm मानों को प्रोटीन सांद्रता में बदलें।
कवरस्लिप्स पर लेपित कोशिकाओं को धीरे से गर्म पीबीएस में 3 बार धोया गया, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए ऊतक सेल फिक्सेटिव (बायोशार्प, बीजिंग, चीन) में 0.1% ट्राइटन एक्स-परमेबिलाइज़ 100 (पीबीएस में पतला; बायोशार्प) में तय किया गया। ) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (पीबीएस में) को ब्लॉक करें।कोशिकाओं को क्रमशः ASC (1:100 तनुकरण) या NLRP3 (1:100 तनुकरण) के विरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर 4°C पर ऊष्मायन किया गया, और Cy3 को बकरी विरोधी खरगोश IgG(H+L) (1:400; EarthOx) लेबल दिया गया। , सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) या एफआईटीसी-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1:400; अर्थॉक्स) रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में।नाभिक को 5 मिनट के लिए होचस्ट 33258 (10 μg/एमएल; यूई, सूज़ौ, चीन) से रंगा गया और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (ओलंपस कॉर्पोरेशन, टोक्यो, जापान) के तहत देखा गया।
चूहों को चार समूहों में विभाजित किया गया था (प्रत्येक समूह में n = 7): (i) पीबीएस-उपचारित नकारात्मक नियंत्रण समूह (केवल पीबीएस; गैवेज 100 μl/माउस पीबीएस जिसके बाद दैनिक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 100 μl/माउस पीबीएस 3 घंटे बाद)।, लगातार 7 दिनों तक);(ii) नकारात्मक नियंत्रण समूह को एमसीसी950 अवरोधक के साथ इलाज किया गया [27] (पीबीएस गैवेज के माध्यम से 100 μl/माउस, 3 घंटे बाद, 10 मिलीग्राम/किग्रा शरीर का वजन [बीडब्ल्यू] एमसीसी950 [पीबीएस में] दैनिक रूप से इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया, अवधि 7 दिन);(iii) जी. डुओडेनलिस सिस्ट संक्रमण समूह (गेवेज द्वारा 1.5 x 106 सिस्ट/माउस, 3 घंटे बाद, 100 μl/माउस पीबीएस इंट्रापेरिटोनियल रूप से 7 दिनों के लिए प्रतिदिन प्रशासित);(iv) जी. डुओडेनलिस सिस्ट संयुक्त संक्रमण समूह एमसीसी950 अवरोधक उपचार समूह (1.5×106 सिस्ट/माउस गैवेज के माध्यम से, 10 मिलीग्राम/किग्रा शरीर का वजन एमसीसी950 इंट्रापेरिटोनियली प्रतिदिन 7 दिनों के लिए 3 बजे)।प्रत्येक चूहे के शरीर के वजन की प्रतिदिन निगरानी की गई और 7वें दिन सभी चूहों को इच्छामृत्यु दे दी गई।कटे हुए डुओडेनम (3 सेमी लंबे) को 1 मिलीलीटर पीबीएस में छोटे टुकड़ों में काटा गया, 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रात भर में सिस्ट नष्ट हो गए, और जी. डुओडेनलिस ट्रोफोज़ोइट्स।हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधलापन के लिए ताजा ग्रहणी (1 सेमी लंबा) अलग किया गया था।
चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया था: (i) MOCK नियंत्रण समूह और (ii) MCC950 अवरोधक समूह।प्रत्येक समूह में पांच उपचार थे (एन = 7/उपचार समूह): (i) पीबीएस उपचार नकारात्मक नियंत्रण समूह (केवल पीबीएस; 100 μl/माउस पीबीएस, इंट्रामस्क्युलर (आईएम) इंजेक्शन (टिबियलिस पूर्वकाल) [28, 29] ;( ii) पीसीडीएनए3.1(+) प्लास्मिड नकारात्मक नियंत्रण समूह (100 माइक्रोग्राम/माउस डीएनए, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से); (iii) जी. डुओडेनलिस सिस्ट संक्रमण सकारात्मक नियंत्रण समूह (1.5 x 106 सिस्ट/माउस, गैवेज के माध्यम से) (iv) ए समूह को प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 (100 μg/माउस डीएनए, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा) से उपचारित किया गया, और (v) समूह को प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 (100 μg/माउस डीएनए) से उपचारित किया गया डीएनए, 12 घंटे बीतने के बाद, एमसीसी950 अवरोधक समूह के चूहों को 7 दिनों के लिए एमसीसी950 (10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) का दैनिक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्राप्त हुआ, जबकि एमओसीके समूह के चूहों को पीबीएस उपचार की समान मात्रा प्राप्त हुई। रक्त के नमूने लिए गए नेत्रगोलक चूहों से एकत्र किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दिया गया और आईएल-1β स्तरों के माप के लिए एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके सीरम के नमूनों को अलग किया गया।
पैंतीस चूहों को पाँच समूहों (n=7/समूह) में विभाजित किया गया था।समूह 1 पीबीएस के साथ इलाज किया गया एक नकारात्मक नियंत्रण समूह था: चूहों को पीबीएस का 100 μl इंट्रामस्क्युलर रूप से और 3 दिन बाद गैवेज द्वारा प्राप्त हुआ।समूह 2 जी. डुओडेनलिस सिस्ट से संक्रमित एक सकारात्मक नियंत्रण समूह है: चूहों को पीबीएस के 100 μl का इंजेक्शन लगाया गया था, और 3 दिन बाद 1.5 x 106 सिस्ट/माउस को इंट्रागैस्ट्रिक रूप से इंजेक्ट किया गया था।तीसरा समूह - डुओडनल सिस्ट संक्रमण के लिए एक नियंत्रण समूह के साथ संयोजन में PCDNA3.1(+) के साथ प्लास्मिड टीकाकरण: चूहों को मौखिक रूप से 100 μg प्लास्मिड डीएनए PCDNA3.1(+)(im) प्राप्त हुआ, कई के लिए 1.5×106 सिस्ट/माउस 3 दिन.समूह 4 और 5 पुनः संयोजक पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डाइन प्लास्मिड या पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन प्लास्मिड जी. डुओडेनलिस सिस्ट संक्रमण के संयोजन में थे।प्रायोगिक समूह: चूहों को 100 माइक्रोग्राम PCDNA3 प्राप्त हुआ।1(+)- जिआर्डिन प्लास्मिड डीएनए (आईएम), फिर 3 दिन बाद, 1.5 × 106 सिस्ट/माउस को गैवेज के माध्यम से इंजेक्ट किया गया।ट्यूब के माध्यम से जी. डुओडेनलिस सिस्ट की शुरूआत के बाद प्रत्येक चूहे के शरीर के वजन की निगरानी की गई।परजीवी भार माप और एचई धुंधला विश्लेषण के लिए ताजा ग्रहणी एकत्र की गई थी।
हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का विश्लेषण पहले प्रकाशित प्रक्रिया [30] के अनुसार किया गया था।ताजा ग्रहणी को टिशू सेल फिक्सेटिव के साथ तय किया गया, पैराफिन में एम्बेडेड किया गया, 4 माइक्रोन वर्गों में काटा गया, एच एंड ई के साथ रंगा गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया गया।सात स्वतंत्र चूहों के सात ऊतक वर्गों में प्रतिनिधि रोग परिवर्तनों का मूल्यांकन उपचार से अनजान एक रोगविज्ञानी द्वारा किया गया था और 200x आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया था।विली की लंबाई और क्रिप्ट की गहराई को पहले वर्णित तरीकों के अनुसार मापा गया था।
इन विट्रो और विवो में परिणाम तीन प्रतियों में प्राप्त किए गए थे।ग्राफ़पैड प्रिज्म 7.00 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक., ला जोला, सीए, यूएसए) का उपयोग करके ग्राफ़ तैयार किए गए थे।दो समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण टी-टेस्ट द्वारा किया गया था, जबकि ≥3 समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर (संस्करण 22.0; एसपीएसएस आईबीएम कॉर्प, आर्मोंक, एनवाई, यूएसए) का उपयोग करके विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया था।विचरण की एकरूपता के लिए डेटा का विश्लेषण लेवेने के परीक्षण और उसके बाद बोनफेरोनी के पोस्ट हॉक परीक्षण (बी) का उपयोग करके किया गया।महत्व को P<0.05, P<0.01, और P<0.001 (महत्वपूर्ण नहीं [ns]) (P>0.05) के रूप में व्यक्त किया जाता है।
क्योटो इनसाइक्लोपीडिया ऑफ जीन्स एंड जीनोम्स (केईजीजी) में जीईवी प्रोटिओमिक्स के हमारे पिछले विश्लेषण से पता चला है कि सूजन संकेतन मार्गों के सक्रियण में कई लक्ष्य शामिल हो सकते हैं [13]।हमने दो आशाजनक लक्ष्य, अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन का चयन किया, इन अणुओं को बढ़ाया और पीसीडीएनए3.1(+) यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वेक्टर के निर्माण के लिए उनका उपयोग किया।अनुक्रमण के बाद, पुनः संयोजक PCDNA3.1 (+) - अल्फा -2 और अल्फा -7.3 जियार्डिन अभिव्यक्ति प्लास्मिड को प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, और सूजन के कैस्पेज़ -1 पी 20 हस्ताक्षर प्रोटीन (सक्रिय कैस्पेज़ -1 का एक टुकड़ा) की पहचान की गई। प्रमुख अणुओं को स्पष्ट करने के रूप में जो सूजन को ट्रिगर कर सकते हैं।परिणामों से पता चला कि अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन जीईवी के समान पी20 कैस्पेज़-1 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं।अनुपचारित नकारात्मक नियंत्रण (केवल पीबीएस) और प्लास्मिड नियंत्रण PCDNA3.1(+) (चित्र 1) में कैस्पेज़-1 सक्रियण पर कोई प्रभाव नहीं पाया गया।
PCDNA3.1(+)-अल्फ़ा-2 और अल्फ़ा-7.3 जिआर्डिन द्वारा p20 कैस्पेज़-1 सक्रियण का मापन।पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डाइन (प्रत्येक लेन के ऊपर) को प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और 24 घंटे बाद कल्चर सुपरनैनेटेंट काटा गया।वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग सिग्नेचर कैस्पेज़-1 पी20 इन्फ्लेमसोम प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को मापने के लिए किया गया था।पीबीएस-केवल उपचार समूह (लेन सी) और पीसीडीएनए3.1(+) मोनोथेरेपी समूह (पीसीडीएनए3.1 लेन) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और जीईवी उपचार समूह का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।प्रत्येक प्रोटीन में एक हिस्टिडाइन टैग का पता लगाकर पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि की गई, और अपेक्षित प्रोटीन बैंड अल्फा -2 जिआर्डिन (38.2 केडीए) और अल्फा-7.3 जिआर्डिन (37.2 केडीए) थे।जीईवी, जिआर्डिया डुओडेनम बाह्यकोशिकीय पुटिका, पीसीडीएनए3.1(+), इकोआरवी-रैखिकीकृत वेक्टर, एसयूपी, सतह पर तैरनेवाला
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अल्फा-2 जिआर्डाइन और अल्फा-7.3 जिआर्डाइन पी20 कैस्पेज़-1 अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं और मेजबान एनएलआरपी3 सूजन प्रतिक्रिया को सक्रिय करने में भूमिका निभाते हैं, पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डाइन और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा -7.3 जिआर्डिन को पुनः संयोजक प्लास्मिड डीएनए के साथ प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और प्रमुख सूजन प्रोटीन एनएलआरपी 3 की अभिव्यक्ति, स्थानीयकरण और ओलिगोमेराइजेशन के स्तर निर्धारित किए गए थे।इस प्रयोग में, GEV का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में किया गया था, और कोई उपचार समूह (केवल पीबीएस) या PCDNA3.1(+) ट्रांसफ़ेक्शन उपचार समूह नकारात्मक समूह नहीं था।परिणामों से पता चला कि, जीईवी समूह की तरह, जिआर्डिन पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 और जिआर्डिन पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 के पुनः संयोजक प्लास्मिड डीएनए के परिणामस्वरूप एनएलआरपी3, प्रो-आईएल-1β और का अपनियमन हुआ। प्रोकैस्पेज़-1 और कैस्पेज़-1 सक्रियण (चित्र 2ए)।इसके अलावा, दोनों जियार्डिन ने महत्वपूर्ण IL-1β स्राव प्रेरित किया (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; अल्फा-2 जिआर्डाइन: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;अल्फा-7.3 जियार्डिन: एनोवा, एफ(4, 10) = 1.625, पी<0.0001;जीईवी: एनोवा, एफ(4, 10) = 1.625, पी = 0.0047) (चित्र 2बी)।PCDNA3.1(+)-alpha-2 या PCDNA3.1(+)-alpha- के विपरीत अधिकांश ASC प्रोटीन गैर-उपचार समूह में या PCDNA3.1(+) प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए उपचार समूह में मोनोमेरिक थे। 7.3 जिआर्डिन.एएससी ऑलिगोमेराइजेशन जीईवी सकारात्मक नियंत्रण समूह या समूह के पुनः संयोजक प्लास्मिड डीएनए में हुआ, जो एक ऑलिगोमेरिक रूप दिखा रहा है (चित्रा 2 सी)।इन प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि अल्फा-2 जियार्डिन और अल्फा-7,3 जियार्डिन एनएलआरपी3 सूजन सक्रियण को प्रेरित कर सकते हैं।एएससी और एनएलआरपी3 के स्थानीयकरण के बाद के इम्यूनोफ्लोरेसेंट अध्ययनों से पता चला कि नकारात्मक नियंत्रण समूह में, एएससी प्रोटीन पूरे साइटोप्लाज्म में बिखरा हुआ था और जियार्डिन या पीसीडीएनए3 के साथ पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 की उत्तेजना पर एक डॉट सिग्नल के रूप में दिखाई देता था।1(+)-अल्फा-7,3 जियार्डिन समूह या जीईवी सकारात्मक नियंत्रण समूह (चित्र 2डी)।नकारात्मक नियंत्रण और प्लास्मिड-उपचारित PCDNA 3.1 समूहों में, NLRP3 प्रोटीन सिग्नल का पता नहीं लगाया गया, जबकि PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 जियार्डिन या PCDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 के जवाब में एक फ्लोरोसेंट सिग्नल डॉट पता चला था।.जिआर्डिन साइटोप्लाज्म में या एचईवी की उत्तेजना पर पाए जाते हैं (चित्र 2e)।ये आंकड़े आगे प्रदर्शित करते हैं कि जी. डुओडेनलिस जिआर्डिन अल्फा-2 और जिआर्डिन अल्फा-7.3 माउस प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम को सक्रिय करते हैं।
PCDNA3.1(+)-alpha-2 giardin और PCDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज में NLRP3 इन्फ्लेमसोम को सक्रिय करते हैं।पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड PCDNA3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डिन और PCDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 जिआर्डिन को प्राथमिक म्यूरिन पेरिटोनियल मैक्रोफेज और कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट करें, या अभिव्यक्ति, ऑलिगोमेराइजेशन के विश्लेषण के लिए 24 घंटे के भीतर सतह पर तैरनेवाला काट लें। , स्राव।और प्रमुख सूजन संबंधी प्रोटीनों का स्थानीयकरण।पीबीएस-केवल (सी) समूह और पीसीडीएनए3.1(+) एकल उपचार समूह को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और जीईवी उपचार समूह को सकारात्मक समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया था।वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा एनएलआरपी3, प्रो-आईएल-1बीटा, प्रो-कैस्पेज़-1 और पी20 कैस्पेज़-1 सहित प्रमुख सूजन वाले प्रोटीन एनएलआरपी3 का पता लगाया गया।बी सतह पर तैरने वालों में IL-1β के स्राव का स्तर एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर संस्करण 22.0 का उपयोग करके विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया था।तारांकन समूह **पी<0.01 और ***पी<0.001 के बीच महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।सी छर्रों में एएससी ऑलिगोमेराइजेशन स्तर डीएसएस क्रॉस-लिंकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, जबकि सेल लाइसेट्स में एएससी स्तर का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था।डी इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके आईएससी स्थानीयकरण का विज़ुअलाइज़ेशन।ई इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग एनएलआरपी3 के स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए किया गया था।एएससी, एपोप्टोटिक स्पेक-लाइक प्रोटीन;आईएल, इंटरल्यूकिन;एनएलआरपी3, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेराइजेशन-जैसे रिसेप्टर 3;एनएस, महत्वपूर्ण नहीं (पी > 0.05)
जी. डुओडेनैलिस और इसके द्वारा स्रावित जीईवी दोनों एनएलआरपी3 इन्फ़्लैमसोम को सक्रिय करते हैं और इन विट्रो में मेजबान सूजन प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं।इस प्रकार, जी. डुओडेनैलिस की रोगजनन क्षमता में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है।इस मुद्दे की जांच करने के लिए, हमने जी. डुओडेनलिस सिस्ट से संक्रमित चूहों और जी. डुओडेनलिस सिस्ट + एमसीसी950 इनहिबिटर उपचार से संक्रमित चूहों के बीच एक प्रयोग डिजाइन किया और जी. डुओडेनलिस सिस्ट से संक्रमित होने पर एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम अभिव्यक्ति की तुलना की।प्रयोग की एक विस्तृत योजना चित्र 3ए में दिखाई गई है।विभिन्न उपचार समूहों में चूहों के शरीर के वजन में परिवर्तन की निगरानी सिस्ट से संक्रमण के बाद 7 दिनों तक की गई, और परिणाम चित्र 3बी में दिखाए गए हैं।शुद्ध पीबीएस से उपचारित समूह की तुलना में, परिणामों से पता चला कि (i) जी. डुओडेनलिस सिस्ट से संक्रमित चूहों का शरीर का वजन संक्रमण के बाद 3 दिन से 7 दिन तक कम हो गया;(ii) MCC950 अवरोधक के साथ उपचार का चूहों के शरीर के वजन पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा।.एकल संक्रमण समूह की तुलना में, एमसीसी950 से उपचारित ग्रहणी संक्रमण समूह का बीडब्ल्यू अलग-अलग डिग्री तक कम हो गया (दिन 1: एनोवा, एफ(3,24) = 1.885, पी = 0.0148; दिन 2: एनोवा, एफ(3,24) ) = 0.4602, पी<0.0001; दिन 3: एनोवा, एफ(3, 24) = 0.8360, पी = 0.0010; दिन 4: एनोवा, एफ(3, 24) = 1.683, पी = 0.0052; (3, 24)=0.6497, पी=0.0645; दिन 6: एनोवा, एफ(3, 24)=5.457, पी=0.0175; दिन 7: एनोवा, एफ(3, 24) = 2.893, पी = 0.0202)।ये आंकड़े दर्शाते हैं कि एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम चूहों को ग्रहणी संक्रमण के शुरुआती चरण (2-4 दिन) में महत्वपूर्ण वजन घटाने से बचाता है।फिर हमने डुओडनल लैवेज द्रव में जी. डुओडेनलिस ट्रोफोज़ोइट्स का पता लगाने का लक्ष्य रखा और परिणाम चित्र 3सी में दिखाए गए हैं।जी. डुओडेनैलिस सिस्ट संक्रमण समूह की तुलना में, एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम (टी(12) = 2.902, पी = 0.0133) को अवरुद्ध करने के बाद ग्रहणी में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या में काफी वृद्धि हुई है।अकेले पीबीएस और एमसीसी950 से इलाज किए गए नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में, एचई से सने डुओडेनल ऊतकों ने दिखाया: (i) जी. डुओडेनलिस सिस्ट संक्रमण के परिणामस्वरूप डुओडेनल विली (एनोवा, एफ (3, 24) = 0.4903, पी = 0.0488) को नुकसान हुआ। ) और क्रिप्ट शोष (एनोवा, एफ(3,24) = 0.4716, पी = 0.0089);(ii) जी. डुओडेनैलिस सिस्ट से संक्रमित चूहों के ग्रहणी और एमसीसी950 अवरोधकों से इलाज किया गया।ग्रहणी विली क्षतिग्रस्त और मृत हो गए थे (एनोवा, एफ(3, 24) = 0.4903, पी = 0.0144) शोष और क्रिप्ट ब्रांचिंग के साथ (एनोवा, एफ(3, 24) = 0.4716, पी = 0, 0481) (चित्र 3डी- एफ) ।इन परिणामों से पता चलता है कि एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम जी. डुओडेनलिस की रोगजनन क्षमता को कम करने में भूमिका निभाता है।
जिआर्डिया डुओडेनम संक्रमण में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका।चूहों को डुओडेनोकोकल सिस्ट से नष्ट किया गया (iv) और फिर MCC950 (आईपी) के साथ या उसके बिना इलाज किया गया।पीबीएस या एमसीसी950 वाले एकल उपचार समूहों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था।प्रायोगिक समूह और उपचार आहार.बी विभिन्न उपचार समूहों में से प्रत्येक में चूहों के शरीर के वजन की 7 दिनों तक निगरानी की गई।जी. डुओडेनलिस संक्रमण समूह और जी. डुओडेनलिस + एमसीसी950 संक्रमण उपचार समूह के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर संस्करण 22.0 का उपयोग करके टी-परीक्षण द्वारा किया गया था।तारांकन *P<0.05, **P<0.01, या ***P<0.001 पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।सी परजीवी भार का निर्धारण डुओडनल लैवेज द्रव में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या की गणना करके किया गया था।जी. डुओडेनलिस संक्रमण समूह और जी. डुओडेनलिस + एमसीसी950 संक्रमण उपचार समूह के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर संस्करण 22.0 का उपयोग करके टी-परीक्षण द्वारा किया गया था।तारांकन *P <0.05 पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।डी हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) डुओडनल हिस्टोपैथोलॉजी के धुंधला परिणाम।लाल तीर विली को नुकसान का संकेत देते हैं, हरे तीर क्रिप्ट को नुकसान का संकेत देते हैं।स्केल बार: 100 µm.ई, एफ डुओडनल विलस ऊंचाई और माउस क्रिप्ट ऊंचाई का सांख्यिकीय विश्लेषण।तारांकन *P<0.05 और **P<0.01 पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।परिणाम 7 स्वतंत्र जैविक प्रयोगों से लिए गए हैं।बीडब्ल्यू, शरीर का वजन;आईजी, इंट्रागैस्ट्रिक डिलीवरी मार्ग;आईपी, इंट्रापेरिटोनियल डिलीवरी मार्ग;एनएस, महत्वपूर्ण नहीं (पी > 0.05);पीबीएस, फॉस्फेट बफर्ड खारा;डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार
IL-1β का स्राव सूजन सक्रियण की पहचान है।यह निर्धारित करने के लिए कि क्या जी. डुओडेनलिस अल्फ़ा-2 जिआर्डिन और अल्फ़ा-7.3 जिआर्डाइन विवो में एनएलआरपी3 होस्ट इन्फ्लामेसोम को सक्रिय करते हैं, हमने अनुपचारित डब्ल्यूटी चूहों (शम समूह) और एनएलआरपी 3 इन्फ्लामेसोम-अवरुद्ध चूहों (एमसीसी950 बाधित उपचार समूह) का उपयोग किया।प्रयोग की एक विस्तृत योजना चित्र 4ए में दिखाई गई है।प्रायोगिक समूहों में पीबीएस से उपचारित चूहे, गैवेज द्वारा जी. डुओडेनलिस सिस्ट का उपचार, पीसीडीएनए3.1 का इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जियार्डिन या पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन का इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन शामिल थे।पुनः संयोजक प्लास्मिड के इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के 7वें दिन, सीरम एकत्र किया गया और प्रत्येक समूह में IL-1β का स्तर निर्धारित किया गया।जैसा कि चित्र 4बी में दिखाया गया है, MOCK समूह में: (i) पीबीएस समूह की तुलना में, PCDNA3.1 उपचार का IL-1β स्राव (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998) पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, हालाँकि, जी. डुओडेनलिस सिस्ट समूह (एनोवा, एफ(4, 29) = 4.062, पी = 0.0002), (ii) पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जियार्डिन और पीसीडीएनए3 में आईएल-बीटा स्राव काफी बढ़ गया था।1- अल्फा-7.3 जियार्डिन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन से सीरम IL-1β स्तर में काफी वृद्धि हुई (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) PCDNA3.1-अल्फा-7,3 जिआर्डिन ने PCDNA3.1-अल्फा-2 जिआर्डिन इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन समूह (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) में IL -1β स्राव के उच्च स्तर को प्रेरित किया। .MCC950 उपचार समूह और MOCK समूह में प्रत्येक समूह की तुलना में: (i) PBS नियंत्रण समूह और PCDNA3.1 नियंत्रण समूह में IL-1β स्राव स्तर MCC950 अवरोधक को अवरुद्ध करने के बाद कुछ हद तक कम हो गया, लेकिन अंतर नहीं था महत्वपूर्ण (पीबीएस: एनोवा, एफ (9, 58) = 3.540, पी = 0.4912 पीसीडीएनए3.1: एनोवा, एफ(9, 58) = 3.540, पी = 0.5949);(ii) MCC950 को ब्लॉक करने के बाद।, जी. डुओडेनलिस सिस्ट-संक्रमित समूह, पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन समूह, और पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन समूह (जी. डुओडेनलिस: एनोवा, एफ(9) में आईएल-1β स्राव काफी कम हो गया था। , 58) = 3.540, पी = 0.0120; पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(9, 58) = 3.540, पी = 0.0447; पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डिन: एनोवा, एफ(9, 58) ) = 3.540, पी = 0.0164)।इन परिणामों से पता चलता है कि अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा-7.3 जिआर्डिन विवो में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की सक्रियता में मध्यस्थता करते हैं।
PCDNA3.1(+)-जिआर्डाइन्स विवो में NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमसोम को सक्रिय करते हैं।चूहों को पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डाइन या पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन से प्रतिरक्षित किया गया (आईएम) और फिर एमसीसी950 (आईपी; एमसीसी950 समूह) या नहीं (डमी समूह) के साथ इलाज किया गया ).पीबीएस या पीसीडीएनए3.1(+) प्लास्मिड उपचार समूह का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, जी. डुओडेनलिस सिस्ट उपचार समूह का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।प्रायोगिक समूह और उपचार आहार.चूहों में IL-1β का सीरम स्तर 7वें दिन एलिसा परख द्वारा मापा गया।MOCK समूह में समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, और MOCK समूह और MCC950 समूह के बीच अंतर का विश्लेषण SPSS सॉफ़्टवेयर संस्करण 22.0 के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।तारांकन MOCK समूह में उपचार समूहों, *पी<0.05 और ***पी<0.001; के बीच महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं;डॉलर चिह्न ($) P<0.05 पर MOCK समूह और MCC950 समूह के प्रत्येक समूह के बीच महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।सात स्वतंत्र जैविक प्रयोगों के परिणाम।मैं, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन, एनएस, महत्वपूर्ण नहीं (पी > 0.05)
जी. डुओडेनलिस संक्रामकता पर एनएलआरपी3 होस्ट इन्फ्लेमसोम के अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन-मध्यस्थता सक्रियण के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने डब्ल्यूटी सी57बीएल/6 चूहों का इस्तेमाल किया और अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा-7.3 जिआर्डिन इंजेक्ट किया।प्लास्मिड को जी. डुओडेनलिस सिस्ट की गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से 3 दिनों के बाद इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किया गया था, जिसके बाद चूहों पर 7 दिनों तक नजर रखी गई थी।प्रयोग की एक विस्तृत योजना चित्र 5ए में दिखाई गई है।प्रत्येक चूहे के शरीर का वजन हर दिन मापा जाता था, गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से प्रशासन के 7 वें दिन ताजा ग्रहणी ऊतक के नमूने एकत्र किए गए थे, ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या मापी गई थी, और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन देखे गए थे।जैसा कि चित्र 5बी में दिखाया गया है, भोजन का समय बढ़ने के साथ, प्रत्येक समूह में चूहों का बीडब्ल्यू धीरे-धीरे बढ़ गया।जी. डुओडेनलिस सिस्ट के इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन के तीसरे दिन चूहों का एमटी कम होना शुरू हुआ, और फिर धीरे-धीरे बढ़ गया।अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा7.3 जिआर्डिन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन से प्रेरित एनएलआरपी3 इनफ्लेमसोम के सक्रियण से चूहों में वजन में काफी कमी आई (दिन 1: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डिन, एनोवा, एफ(4, 30) = 1.399, पी = 0 .9754 दिन 1: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30)=1.399, पी=0.9987 दिन 2: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.3172, पी = 0.9979; दिन 2: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.3172, पी = 0.8409; दिन 3: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ( 4, 30) = 0.8222, पी = 0.0262 दिन 3: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.8222, पी = 0.0083; दिन 4: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन, एनोवा , एफ(4, 30) = 0.5620, पी = 0.0012, दिन 4: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.5620, पी <0.0001, दिन 5: पीसीडीएनए3.1-अल्फा - 2 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.9728, पी <0.0001 दिन 5: पीसीडीएनए3.1-अल्फा -7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.9728, पी <0.0001 दिन 6: पीसीडीएनए3 .1 - अल्फा-2 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.7154, पी = 0.0012, दिन 6: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डिन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.7154, पी = 0.0006;दिन 7: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.5369, पी<0.0001 दिन 7: पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन, एनोवा, एफ(4, 30) = 0.5369, पी <0.0001).ग्रहणी में परजीवी भार का आकलन किया गया (चित्र 5सी)।अनुपचारित सकारात्मक नियंत्रण और खाली PCDNA3.1 वेक्टर के साथ इंजेक्ट किए गए समूह की तुलना में, α-2 जिआर्डाइन और α-7,3 जिआर्डाइन (pcDNA3.1-अल्फा) के साथ इंजेक्ट किए गए समूहों में जी. डुओडेनलिस ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या काफी कम हो गई थी। -2 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(3, 24) = 1.209, पी = 0.0002, पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(3, 24) = 1.209, पी<0.0001)।इसके अलावा, जिआर्डिन अल्फ़ा-7.3 चूहों में जिआर्डिन अल्फ़ा-2 (एनोवा, एफ(3, 24) = 1.209, पी = 0.0081) की तुलना में अधिक सुरक्षात्मक था।एचई स्टेनिंग के परिणाम अंजीर में दिखाए गए हैं।5डी-एफ.जिन चूहों को अल्फा-2 जिआर्डाइन और अल्फा-7.3 जिआर्डाइन का इंजेक्शन लगाया गया था, उनमें ग्रहणी ऊतक के घाव कम थे, जो कि विलस क्षति से प्रकट हुए थे, उन चूहों की तुलना में जिन्हें जी. डुओडेनलिस का इंजेक्शन लगाया गया था और जिन चूहों को खाली पीसीडीएनए3 वेक्टर .1 ज़ूम के साथ संयोजन में जी. डुओडेनलिस का इंजेक्शन लगाया गया था।(पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(3, 24) = 2.466, पी = 0.0035 या पी = 0.0068; पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(3, 24) = 2.466, पी = 0.0028 या पी = 0.0055) और कम क्रिप्ट शोष (पीसीडीएनए3.1-अल्फा-2 जिआर्डाइन: एनोवा, एफ(3, 24) = 1.470, पी = 0.0264 या पी = 0.0158; पीसीडीएनए3.1-अल्फा-7.3 जिआर्डिन: एनोवा , एफ(3, 24) = 1.470, पी = 0.0371 या पी = 0.0191)।इन परिणामों से पता चलता है कि अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा-7,3 जिआर्डिन विवो में एनएलआरपी3 इनफ्लेमसोम को सक्रिय करके जी. डुओडेनलिस की संक्रामकता को कम करते हैं।
जी. डुओडेनलिस संक्रमण में PCDNA3.1(+)-जिआर्डिन की भूमिका।चूहों को पुनः संयोजक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डाइन या पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन से प्रतिरक्षित (आईएम) किया गया और फिर जी. डुओडेनलिस सिस्ट (आईजी) से चुनौती दी गई।पीबीएस समूह और PCDNA3.1(+) + ग्रहणी पुटी उपचार समूह का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में किया गया था, और ग्रहणी पुटी उपचार समूह का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में किया गया था।प्रायोगिक समूह और उपचार आहार.बी विभिन्न उपचार समूहों में से प्रत्येक में चूहों के एमटी की चुनौती के बाद 7 दिनों तक निगरानी की गई।तारांकन जी डुओडेनलिस समूह और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जियार्डिन समूह, *पी <0.05, **पी <0.01, और ***पी <0.001; में समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं;डॉलर चिह्न ($) जी. डुओडेनलिस के प्रत्येक समूह और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जार्डाइन समूह, $$P<0.01 और $$$P<0.001 के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है।सी परजीवी भार ग्रहणी (3 सेमी लंबा) से 1 मिलीलीटर ग्रहणी लैवेज में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या की गणना करके निर्धारित किया गया था और ग्रहणी के प्रति सेमी परजीवियों की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया था।जी डुओडेनलिस संक्रमण समूह, पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-2 जिआर्डाइन समूह और पीसीडीएनए3.1(+)-अल्फा-7.3 जिआर्डाइन समूह के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर संस्करण 22.0 का उपयोग करके एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था।तारांकन **P<0.01 और ***P<0.001 पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।घ ग्रहणी में हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन।लाल तीर विली को नुकसान का संकेत देते हैं, हरे तीर क्रिप्ट को नुकसान का संकेत देते हैं।स्केल बार: 100 µm.ई, एफ माउस डुओडनल विलस ऊंचाई (ई) और क्रिप्ट ऊंचाई (एफ) का सांख्यिकीय विश्लेषण।चित्र 1डी में समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एसपीएसएस सॉफ्टवेयर संस्करण 22.0 का उपयोग करके एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था।तारांकन *P<0.05 और **P<0.01 पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।सात स्वतंत्र जैविक प्रयोगों के परिणाम।एनएस, महत्वपूर्ण नहीं (पी > 0.05)
जिआर्डिया डुओडेनम मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों का एक प्रसिद्ध आंत्र परजीवी है जो जिआर्डियासिस का कारण बनता है।2004 में, इसे 6 वर्षों में इसके उच्च प्रसार के कारण WHO उपेक्षित रोग पहल में शामिल किया गया था, विशेषकर निम्न सामाजिक आर्थिक स्थिति वाले समुदायों में [32]।जी. डुओडेनैलिस संक्रमण के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।यह बताया गया है कि माउस मैक्रोफेज बाह्यकोशिकीय जाल छोड़ कर जी डुओडेनलिस को निगल लेते हैं और मार देते हैं [33]।हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जी. डुओडेनलिस, एक गैर-आक्रामक बाह्य कोशिकीय परजीवी, मेजबान सूजन प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए माउस मैक्रोफेज में p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 और NLRP3 सूजन संकेतन मार्गों को सक्रिय करता है, और जारी GEV इस प्रक्रिया को बढ़ा सकता है।13], 24]।हालाँकि, GEV में NLRP3 इन्फ्लामेसोम-विनियमित सूजन में शामिल सटीक PAMPs और जिआर्डियासिस में NLRP3 इन्फ्लामेसोम की भूमिका को स्पष्ट किया जाना बाकी है।इन दो सवालों पर प्रकाश डालने के लिए हमने यह अध्ययन किया।
एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में स्थित होता है और इसे यूरिक एसिड क्रिस्टल, विषाक्त पदार्थ, बैक्टीरिया, वायरस और परजीवी जैसे विभिन्न कणों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है।जीवाणु अध्ययनों में, विषाक्त पदार्थों को प्रमुख पीएएमपी के रूप में पहचाना गया है जो सूजन सेंसर को सक्रिय करते हैं, जिससे सूजन और कोशिका मृत्यु होती है [34]।कुछ संरचनात्मक रूप से विविध विषाक्त पदार्थ, जैसे स्टैफिलोकोकस ऑरियस [35] और एस्चेरिचिया कोली [36] से हेमोलिसिन, एंटरोटॉक्सिन (एनएचई) [37] से हेमोलिसिन बीएल (एचबीएल), एनएलआरपी3 सूजन की सक्रियता को प्रेरित करते हैं।वायरल अध्ययनों से पता चला है कि SARS-COV-2 लिफ़ाफ़ा (E) प्रोटीन [38] और ज़िका वायरस NS5 प्रोटीन [39] जैसे विषाणु प्रोटीन NLRP3 रिसेप्टर द्वारा मान्यता प्राप्त महत्वपूर्ण PAMP हैं।परजीवी अध्ययनों में, कई परजीवियों को मेजबान इन्फ्लेमसोम सक्रियण से जुड़ा हुआ बताया गया है, जैसे टोक्सोप्लाज्मा गोंडी, ट्राइकोमोनास वेजिनेलिस [40], ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी [41], और लीशमैनिया [42]।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी के विषाणु से जुड़े घने ग्रेन्युल प्रोटीन GRA35, GRA42 और GRA43, लुईस चूहे मैक्रोफेज में पायरोप्टोसिस को शामिल करने के लिए आवश्यक हैं [43]।इसके अलावा, लीशमैनिया के कुछ अध्ययनों ने एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम में शामिल व्यक्तिगत अणुओं पर ध्यान केंद्रित किया है, जैसे परजीवी झिल्ली लिपोफॉस्फोग्लाइकन [44] या जिंक मेटालोप्रोटीज़ [45]।जीन के एनेक्सिन-जैसे अल्फा-जिआर्डिन परिवार में, अल्फा-1 जिआर्डिन को एक संभावित वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में दिखाया गया है जो एक माउस मॉडल [18] में जी. डुओडेनलिस के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है।हमारे अध्ययन में, हमने जी. डुओडेनलिस विषाणु कारक अल्फा-2 और अल्फा-7,3 जिआर्डिन का चयन किया, जो जिआर्डिया के लिए अद्वितीय हैं लेकिन अपेक्षाकृत कम रिपोर्ट किए गए हैं।सूजन सक्रियण के विश्लेषण के लिए इन दो लक्ष्य जीनों को PCDNA3.1(+) यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली वेक्टर में क्लोन किया गया था।
हमारे माउस मॉडल में, कटे हुए कैस्पेज़ टुकड़े सूजन सक्रियण के मार्कर के रूप में काम करते हैं।उत्तेजना होने पर, एनएलआरपी3 एएससी के साथ इंटरैक्ट करता है, प्रोकैस्पेज़ को भर्ती करता है, और सक्रिय कैस्पैसेस उत्पन्न करता है जो प्रो-आईएल-1β और प्रो-आईएल-18 को क्रमशः परिपक्व आईएल-1β और आईएल-18 में विभाजित करता है -18।सूजन संबंधी कैसपेज़ (कैस्पैसेस-1, -4, -5 और -11) सिस्टीन प्रोटीज़ का एक संरक्षित परिवार है जो जन्मजात रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं और सूजन और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु में शामिल हैं [46]।कैस्पेज़-1 कैनोनिकल इन्फ्लामासोम्स [47] द्वारा सक्रिय होता है, जबकि कैस्पेज़-4, -5, और -11 एटिपिकल इन्फ्लेमासोम्स [48] के निर्माण के दौरान विखंडित होते हैं।इस अध्ययन में, हमने एक मॉडल के रूप में माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज का उपयोग किया और जी डुओडेनलिस संक्रमण के अध्ययन में मेजबान एनएलआरपी 3 सूजन सक्रियण के एक मार्कर के रूप में पी 20 कैस्पेज़ -1 क्लीवेड कैस्पेज़ -1 की जांच की।परिणामों से पता चला कि कई अल्फा-जिआर्डिन सूजन की विशिष्ट सक्रियता के लिए जिम्मेदार हैं, जो बैक्टीरिया और वायरस में शामिल प्रमुख विषाणु अणुओं की खोज के अनुरूप है।हालाँकि, हमारा अध्ययन केवल एक प्रारंभिक स्क्रीन है और ऐसे अन्य अणु भी हैं जो गैर-शास्त्रीय इन्फ्लामासोम को सक्रिय कर सकते हैं, क्योंकि हमारे पिछले अध्ययन में जी. डुओडेनलिस संक्रमण में शास्त्रीय और गैर-शास्त्रीय दोनों प्रकार के इन्फ्लामासोम पाए गए थे [13]।आगे यह निर्धारित करने के लिए कि क्या उत्पन्न पी20 कैस्पेज़-1 एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के साथ जुड़ा हुआ है, हमने प्रमुख अणु प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर और एएससी ऑलिगोमेराइजेशन स्तर निर्धारित करने के लिए अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन को माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज में ट्रांसफ़ेक्ट किया, यह पुष्टि करते हुए कि दोनों α-जिआर्डिन सक्रिय हैं। इन्फ्लेमसोम एनएलआरपी3.हमारे परिणाम मानको-प्राइखोडा एट अल से थोड़े अलग हैं, जिन्होंने बताया कि अकेले जी. मुरिस या ई. कोली ईपीईसी उपभेदों के साथ काको-2 कोशिकाओं की उत्तेजना एनएलआरपी3, एएससी और कैस्पेज़-1 की प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ा सकती है। हालांकि महत्वपूर्ण रूप से नहीं, जबकि जी. मुरिस और ई. कोली के कॉस्टिम्यूलेशन ने तीन प्रोटीनों के स्तर को कैसे बढ़ाया [49]।यह विसंगति जिआर्डिया प्रजातियों, कोशिका रेखाओं और प्राथमिक कोशिकाओं के चयन में अंतर के कारण हो सकती है।हमने 5-सप्ताह की मादा डब्ल्यूटी सी57बीएल/6 चूहों में एमसीसी950 का उपयोग करके विवो परीक्षण भी किया, जो जी. डुओडेनलिस के प्रति अधिक संवेदनशील हैं।MCC950 एक शक्तिशाली और चयनात्मक छोटा अणु NLRP3 अवरोधक है जो नैनोमोलर सांद्रता पर विहित और गैर-विहित NLRP3 सक्रियण को अवरुद्ध करता है।MCC950 NLRP3 सक्रियण को रोकता है लेकिन AIM2, NLRC4, और NLRP1 सूजन पथों या TLR सिग्नलिंग पथों की सक्रियता को प्रभावित नहीं करता है [27]।MCC950 NLRP3 सक्रियण को अवरुद्ध करता है लेकिन NLRP3 आरंभ, K+ प्रवाह, Ca2+ प्रवाह, या NLRP3 और ASC के बीच अंतःक्रिया को बाधित नहीं करता है;इसके बजाय, यह एएससी ऑलिगोमेराइजेशन [27] को अवरुद्ध करके एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण को रोकता है।इसलिए, हमने जिआर्डिन इंजेक्शन के बाद एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की भूमिका निर्धारित करने के लिए एक विवो अध्ययन में एमसीसी950 का उपयोग किया।सक्रिय कैसपेज़-1 पी10 प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स प्रो-आईएल-1β और प्रो-आईएल-18 को परिपक्व आईएल-1β और आईएल-18 में विभाजित करता है [50]।इस अध्ययन में, एमसीसी950 के साथ या उसके बिना जियार्डिन-उपचारित चूहों में सीरम आईएल-1β स्तर का उपयोग एक संकेतक के रूप में किया गया था कि क्या एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रिय था।जैसा कि अपेक्षित था, MCC950 उपचार ने सीरम IL-1β स्तर को काफी कम कर दिया।ये आंकड़े स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं कि जी. डुओडेनलिस जिआर्डिन अल्फ़ा-2 और जिआर्डिन अल्फ़ा-7.3 एनएलआरपी3 माउस इन्फ्लेमसोम को सक्रिय करने में सक्षम हैं।
पिछले दशक में जमा किए गए महत्वपूर्ण आंकड़ों से पता चला है कि IL-17A, G. muris के खिलाफ प्रतिरक्षा का मुख्य नियामक है, जो IL-17RA सिग्नलिंग को प्रेरित करता है, रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का उत्पादन करता है, और पूरक सक्रियण को नियंत्रित करता है [51]।हालाँकि, जिआर्डिया संक्रमण युवा वयस्कों में अधिक बार होता है, और यह बताया गया है कि युवा चूहों में जिआर्डिया संक्रमण अपने सुरक्षात्मक प्रभाव को बढ़ाने के लिए IL-17A प्रतिक्रिया को सक्रिय नहीं करता है [52], जिससे शोधकर्ताओं को अन्य इम्यूनोमॉड्यूलेटरी जिआर्डिया की तलाश करने के लिए प्रेरित किया जाता है।कृमि संक्रमण के तंत्र.एक हालिया अध्ययन के लेखकों ने बताया कि जी. मुरिस ई. कोली ईपीईसी द्वारा एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम को सक्रिय कर सकता है, जो रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के उत्पादन को बढ़ावा देता है और इसकी लगाव क्षमता और आंत्र पथ में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या को कम करता है, जिससे कोलन की गंभीरता कम हो जाती है। बेसिली के कारण होने वाली बीमारियाँ [49]।एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम विभिन्न रोगों के विकास में शामिल है।अध्ययनों से पता चला है कि स्यूडोमोनास एरुगिनोसा कोशिका मृत्यु से बचने के लिए मैक्रोफेज में ऑटोफैगी को ट्रिगर करता है, और यह प्रक्रिया एनएलआरपी 3 इन्फ्लामेसोम [53] की सक्रियता पर निर्भर करती है।एन. कैनिनम के लिए, एनएलआरपी3 इन्फ्लामेसोम की प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति-मध्यस्थता सक्रियण मेजबान में इसकी प्रतिकृति को सीमित कर देता है, जिससे यह एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बन जाता है [9]।पैराकोसिडिओइड्स ब्रासिलिएन्सिस को माउस अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं में एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमसोम के सक्रियण को प्रेरित करने के लिए पाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप सूजन साइटोकिन आईएल -1β जारी होता है, जो मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [10]।एल. अमेज़ोनेंसिस, एल. मेजर, एल. ब्राज़ीलेंसिस, और एल. इन्फेंटम चागासी सहित कई लीशमैनिया प्रजातियां, मैक्रोफेज में एनएलआरपी3 और एएससी-निर्भर कैस्पेज़-1 के साथ-साथ लीशमैनिया संक्रमण को सक्रिय करती हैं।एनएलआरपी3/एएससी/कैस्पेज़-1 जीन की कमी वाले चूहों में परजीवी प्रतिकृति को बढ़ाया जाता है [11]।ज़ंबोनी एट अल।लीशमैनिया संक्रमण के बारे में बताया गया है कि यह मैक्रोफेज में एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के सक्रियण को प्रेरित करता है, जो इंट्रासेल्युलर परजीवी प्रतिकृति को सीमित करता है।इस प्रकार, लीशमैनिया एक बचाव रणनीति के रूप में एनएलआरपी3 सक्रियण को रोक सकता है।विवो अध्ययनों में, एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम ने लीशमैनिया के उन्मूलन में योगदान दिया, लेकिन ऊतकों को प्रभावित नहीं किया [54]।इसके विपरीत, हेल्मिंथियासिस अध्ययन में, एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम की सक्रियता ने गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल हेल्मिंथियासिस के खिलाफ मेजबान की सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को दबा दिया [12]।शिगेला दुनिया भर में डायरिया पैदा करने वाले प्रमुख बैक्टीरिया में से एक है।ये बैक्टीरिया P2X7 रिसेप्टर-मध्यस्थता K+ प्रवाह, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, लाइसोसोमल अम्लीकरण और माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के माध्यम से IL-1β उत्पादन को प्रेरित कर सकते हैं।एनएलआरपी3 इन्फ्लेमेसोम शिगेला के खिलाफ मैक्रोफेज की फागोसाइटोसिस और जीवाणुनाशक गतिविधि को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है [55]।प्लाज़मोडियम अध्ययनों से पता चला है कि प्लाज़मोडियम से संक्रमित AIM2, NLRP3 या कैसपेज़-1 की कमी वाले चूहे टाइप 1 इंटरफेरॉन के उच्च स्तर का उत्पादन करते हैं और प्लाज़मोडियम संक्रमण के प्रति अधिक प्रतिरोधी होते हैं [56]।हालाँकि, चूहों में एनएलआरपी3 सूजन के रोगजनक सक्रियण को प्रेरित करने में अल्फा-2 जियार्डिन और अल्फा-7.3 जिआर्डिन की भूमिका स्पष्ट नहीं है।
इस अध्ययन में, एमसीसी950 द्वारा एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम के निषेध ने बीडब्ल्यू को कम कर दिया और चूहों में आंतों के तरल पदार्थ में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या में वृद्धि की, जिसके परिणामस्वरूप ग्रहणी ऊतक में अधिक गंभीर रोग परिवर्तन हुए।अल्फा-2 जिआर्डिन और अल्फा-7.3 जिआर्डिन मेजबान माउस एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम को सक्रिय करते हैं, माउस के शरीर का वजन बढ़ाते हैं, आंतों के तरल पदार्थ में ट्रोफोज़ोइट्स की संख्या को कम करते हैं, और पैथोलॉजिकल डुओडनल घावों को कम करते हैं।इन परिणामों से पता चलता है कि जी. डुओडेनैलिस अल्फा-2 जियार्डिन और अल्फा-7,3 जियार्डिन के माध्यम से एनएलआरपी3 होस्ट इनफ्लेमसोम को सक्रिय कर सकता है, जिससे चूहों में जी. डुओडेनलिस की रोगजनकता कम हो जाती है।
सामूहिक रूप से, हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि अल्फा-2 और अल्फा-7.3 जिआर्डिन एनएलआरपी3 होस्ट इनफ्लेमसोम की सक्रियता को प्रेरित करते हैं और चूहों में जी. डुओडेनलिस की संक्रामकता को कम करते हैं।इसलिए, ये अणु जिआर्डियासिस की रोकथाम के लिए आशाजनक लक्ष्य हैं।
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
लियांग एकेएस, लियांग एएएम, हुआंग एएचसी, सेर्गी केएम, काम जेकेएम।जिआर्डियासिस: एक सिंहावलोकन.हाल ही में यह बात सामने आई थी कि पैट इन्फ्लेम को दवाओं से एलर्जी है।2019;13:134-43।
एस्कोबेडो एए, सिमरमैन एस. जिआर्डियासिस: फार्माकोथेरेपी की समीक्षा।एक फार्मासिस्ट की विशेषज्ञ राय.2007;8: 1885-902.
तियान हुआफेंग, चेन बिन, वेन जियानफेंग।जिआर्डियासिस, दवा प्रतिरोध और नए लक्ष्यों की खोज।डिसॉर्डर दवा के लक्ष्यों को संक्रमित करता है।2010;10:295-302।
वांग ज़ेड, झांग एक्स, जिओ यी, झांग डब्ल्यू, वू एक्स, किन टी, आदि एनएलआरपी3 सूजन संबंधी और सूजन संबंधी बीमारियाँ।ऑक्साइड मेड सेल लोंगेव।2020;2020:4063562।
चेन जीवाई, नुनेज़ जी. आंतों की सूजन और कैंसर में इन्फ्लेमसोम की भूमिका।गैस्ट्रोएंटरोलॉजी.2011;141:1986-99।
पेलेग्रिनी सी, एंटोनियोली एल, लोपेज़-कास्टेजोन जी, ब्लैंडिज़ी सी, फ़ोर्नाई एम। प्रतिरक्षा सहिष्णुता और आंत सूजन के चौराहे पर कैनोनिकल और एटिपिकल एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण।पूर्व-प्रतिरक्षित.2017;8:36.
ली एल, वांग एक्ससी, गोंग पीटी, झांग एन, झांग एक्स, ली एस, एट अल।आरओएस-मध्यस्थता एनएलआरपी3 इन्फ्लेमसोम सक्रियण एन. कैनिनम संक्रमण की प्रतिक्रिया में शामिल है।परजीवी वेक्टर.2020;13:449.