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टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी है जो संक्रमित मेजबान के माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करता है और ब्रेन ट्यूमर के विकास की घटनाओं से जुड़ा हुआ माना जाता है।इस अध्ययन में, हम अनुमान लगाते हैं कि टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण से एक्सोसोमल miRNA-21 ब्रेन ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देता है।टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी2 माइक्रोग्लिया से एक्सोसोम की विशेषता बताई गई और यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के आंतरिककरण की पुष्टि की गई।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी और ट्यूमर सॉर्टिंग से जुड़े माइक्रोआरएनए और माइक्रोआरएनए-21ए-5पी की सरणियों का उपयोग करके एक्सोसोमल माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण किया गया।हमने U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में ट्यूमर से जुड़े जीनों के mRNA स्तर की भी जांच की, एक्सोसोम में miR-21 के स्तर में बदलाव करके और मानव U87 ग्लियोमा सेल प्रसार पर एक्सोसोम के प्रभाव की।Toxoplasma gondii से संक्रमित U87 ग्लियोमा कोशिकाओं के एक्सोसोम में, microRNA-21 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और एंटीट्यूमर जीन (FoxO1, PTEN, और PDCD4) की गतिविधि कम हो जाती है।Toxoplasma से संक्रमित BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम U87 ग्लियोमा कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करते हैं।एक्सोसोम एक माउस ट्यूमर मॉडल में U87 कोशिकाओं के विकास को प्रेरित करते हैं।हम सुझाव देते हैं कि टॉक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी 2 माइक्रोग्लिया में एक्सोसोमल एमआईआर -21 में वृद्धि एंटीट्यूमर जीन को डाउनग्रेड करके यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं में सेल ग्रोथ प्रमोटर के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है।
यह अनुमान लगाया गया है कि 2018 में दुनिया भर में उन्नत कैंसर के 18.1 मिलियन से अधिक मामलों का निदान किया गया था, जिसमें प्रत्येक वर्ष लगभग 297,000 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ट्यूमर का निदान किया गया था (सभी ट्यूमर का 1.6%)1।पिछले शोध से पता चला है कि मानव मस्तिष्क ट्यूमर के विकास के जोखिम कारकों में विभिन्न रासायनिक उत्पाद, पारिवारिक इतिहास और सिर के चिकित्सीय और नैदानिक ​​​​उपकरणों से आयनकारी विकिरण शामिल हैं।हालाँकि, इन विकृतियों का सटीक कारण अज्ञात है।दुनिया भर में लगभग 20% कैंसर संक्रामक एजेंटों के कारण होते हैं, जिनमें वायरस, बैक्टीरिया और परजीवी3,4 शामिल हैं।संक्रामक रोगजनक मेजबान सेल के आनुवंशिक तंत्र को बाधित करते हैं, जैसे कि डीएनए की मरम्मत और सेल चक्र, और पुरानी सूजन और प्रतिरक्षा प्रणाली को नुकसान पहुंचा सकता है।
मानव कैंसर से जुड़े संक्रामक एजेंट सबसे आम वायरल रोगजनक हैं, जिनमें मानव पेपिलोमावायरस और हेपेटाइटिस बी और सी वायरस शामिल हैं।परजीवी भी मानव कैंसर के विकास में एक संभावित भूमिका निभा सकते हैं।कई परजीवी प्रजातियां, जैसे कि शिस्टोसोमा, ओपिशोरचिस विवरिनी, ओ. फेलाइनस, क्लोनोरचिस साइनेंसिस और हाइमेनोलेपिस नाना, को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर 6,7,8 में फंसाया गया है।
टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ है जो संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करता है।अनुमान है कि यह परजीवी दुनिया की लगभग 30% आबादी को संक्रमित कर देगा, जिससे पूरी आबादी जोखिम9,10 पर आ जाएगी।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) सहित महत्वपूर्ण अंगों को संक्रमित कर सकता है, और घातक मेनिन्जाइटिस और एन्सेफलाइटिस जैसी गंभीर बीमारियों का कारण बन सकता है, विशेष रूप से प्रतिरक्षा में अक्षम रोगियों9 में।हालांकि, टोक्सोप्लाज्मा गोंडी भी संक्रमित मेजबान के वातावरण को सेल के विकास और प्रतिरक्षात्मक व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को संशोधित करके बदल सकता है, जिससे एक स्पर्शोन्मुख जीर्ण संक्रमण9,11 का रखरखाव हो सकता है।दिलचस्प बात यह है कि टी। गोंडी प्रचलन और ब्रेन ट्यूमर की घटनाओं के बीच संबंध को देखते हुए, कुछ रिपोर्ट बताती हैं कि विवो में जीर्ण टी। गोंडी संक्रमण के कारण पर्यावरणीय परिवर्तन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से मिलते जुलते हैं।
एक्सोसोम्स को इंटरसेलुलर कम्युनिकेटर्स के रूप में जाना जाता है जो पड़ोसी कोशिकाओं16,17 से प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित जैविक सामग्री वितरित करते हैं।एक्सोसोम ट्यूमर से संबंधित जैविक प्रक्रियाओं जैसे कि एंटी-एपोप्टोसिस, एंजियोजेनेसिस और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मेटास्टेसिस को प्रभावित कर सकते हैं।विशेष रूप से, miRNAs (miRNAs), लंबाई में लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड्स छोटे गैर-कोडिंग RNAs, महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन रेगुलेटर हैं जो miRNA- प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स (miRISC) के माध्यम से 30% से अधिक मानव mRNA को नियंत्रित करते हैं।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी संक्रमित मेजबानों में miRNA अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके जैविक प्रक्रियाओं को बाधित कर सकता है।मेजबान miRNAs में परजीवी की उत्तरजीविता रणनीति को प्राप्त करने के लिए मेजबान जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण संकेत होते हैं।इस प्रकार, टी गोंडी के साथ संक्रमण पर मेजबान मिरना प्रोफाइल में परिवर्तन का अध्ययन करने से हमें मेजबान और टी गोंडी के बीच की बातचीत को और अधिक स्पष्ट रूप से समझने में मदद मिल सकती है।दरअसल, थिरुग्ननम एट अल।15 ने सुझाव दिया कि टी। गोंडी ट्यूमर के विकास से जुड़े विशिष्ट मेजबान miRNAs पर अपनी अभिव्यक्ति में बदलाव करके मस्तिष्क कार्सिनोजेनेसिस को बढ़ावा देता है और पाया कि टी। गोंडी प्रायोगिक जानवरों में ग्लिओमास पैदा कर सकता है।
यह अध्ययन टॉक्सोप्लाज्मा बीवी2 से संक्रमित मेजबान माइक्रोग्लिया में एक्सोसोमल एमआईआर-21 के परिवर्तन पर केंद्रित है।हमने फॉक्सओ1/पी27 के नाभिक में प्रतिधारण के कारण यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं के विकास में परिवर्तित एक्सोसोमल एमआईआर-21 की संभावित भूमिका देखी, जो ओवरएक्सप्रेस्ड एमआईआर-21 का लक्ष्य है।
BV2 से प्राप्त एक्सोसोम को डिफरेंशियल सेंट्रीफ्यूगेशन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और सेलुलर घटकों या अन्य पुटिकाओं के साथ संदूषण को रोकने के लिए विभिन्न तरीकों से मान्य किया गया था।SDS-polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (SDS-PAGE) ने BV2 कोशिकाओं और एक्सोसोम्स (चित्र 1A) से निकाले गए प्रोटीनों के बीच अलग-अलग पैटर्न दिखाए, और एलिक्स की उपस्थिति के लिए नमूनों का मूल्यांकन किया गया, जिसका विश्लेषण एक्सोसोमल प्रोटीन मार्करों के वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था।एलिक्स लेबलिंग एक्सोसोम प्रोटीन में पाई गई लेकिन बीवी2 सेल लाइसेट प्रोटीन (चित्र 1बी) में नहीं।इसके अलावा, BV2 से प्राप्त एक्सोसोम से शुद्ध आरएनए का विश्लेषण बायोएनालाइज़र का उपयोग करके किया गया था।18S और 28S राइबोसोमल सबयूनिट्स एक्सोसोमल RNA माइग्रेशन पैटर्न में शायद ही कभी देखे गए थे, जो विश्वसनीय शुद्धता (चित्र 1C) का संकेत देते हैं।अंत में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने दिखाया कि देखे गए एक्सोसोम आकार में लगभग 60-150 एनएम थे और एक्सोसोम आकारिकी (चित्र। 1 डी) की एक कप जैसी संरचना थी।
BV2 कोशिकाओं से प्राप्त एक्सोसोम की विशेषता।(ए) सुरक्षा डाटा शीट पृष्ठ।प्रोटीन BV2 कोशिकाओं या BV2 से प्राप्त एक्सोसोम से अलग किए गए थे।प्रोटीन पैटर्न कोशिकाओं और एक्सोसोम के बीच भिन्न होते हैं।(बी) एक एक्सोसोमल मार्कर (एलिक्स) का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण।(सी) बीवी2 कोशिकाओं से शुद्ध आरएनए का मूल्यांकन और बायोएनालाइजर का उपयोग करके बीवी2 व्युत्पन्न एक्सोसोम।इस प्रकार, BV2 कोशिकाओं में 18S और 28S राइबोसोमल सबयूनिट्स एक्सोसोमल आरएनए में शायद ही कभी पाए गए।(डी) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि बीवी2 कोशिकाओं से अलग किए गए एक्सोसोम को 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था।एक्सोसोम लगभग 60-150 एनएम आकार और कप के आकार के होते हैं (सॉन्ग और जंग, अप्रकाशित डेटा)।
U87 मानव ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के सेलुलर आंतरिककरण को मुखर माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था।PKH26 लेबल वाले एक्सोसोम U87 कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत हैं।नाभिक को डीएपीआई (छवि 2 ए) के साथ दाग दिया गया था, यह दर्शाता है कि बीवी 2-व्युत्पन्न एक्सोसोम को मेजबान कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जा सकता है और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के वातावरण को प्रभावित कर सकता है।
U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का आंतरिककरण और Toxoplasma RH से संक्रमित BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम ने U87 ग्लियोमा कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित किया।(ए) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापी गई यू87 कोशिकाओं द्वारा घिरे हुए एक्सोसोम।U87 ग्लियोमा कोशिकाओं को PKH26 (लाल) या बिना नियंत्रण के 24 घंटे के लिए लेबल किए गए एक्सोसोम के साथ ऊष्मायन किया गया था।नाभिक को डीएपीआई (नीला) के साथ दाग दिया गया और फिर एक मुखर माइक्रोस्कोप (स्केल बार: 10 माइक्रोन, x 3000) के तहत देखा गया।(बी) U87 ग्लियोमा सेल प्रसार सेल प्रसार परख द्वारा निर्धारित किया गया था।U87 ग्लियोमा कोशिकाओं को संकेतित समय के लिए एक्सोसोम के साथ इलाज किया गया था। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। *P <0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी- टेस्ट द्वारा। *पी <0.05 通过学生t 检验获得। *पी <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के आंतरिककरण की पुष्टि करने के बाद, हमने मानव ग्लियोमा कोशिकाओं के विकास में BV2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-व्युत्पन्न एक्सोसोम की भूमिका की जांच करने के लिए सेल प्रसार assays का प्रदर्शन किया।टी. गोंडी-संक्रमित बीवी2 कोशिकाओं से एक्सोसोम के साथ यू87 कोशिकाओं के उपचार से पता चला है कि टी. गोंडी-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम ने नियंत्रण (छवि 2बी) की तुलना में यू87 कोशिकाओं के काफी अधिक प्रसार का कारण बना।
इसके अलावा, U118 कोशिकाओं के विकास के U87 के समान परिणाम थे, क्योंकि टोक्सोप्लाज्मा उत्तेजित एक्सोसोम ने प्रसार के उच्चतम स्तर (डेटा नहीं दिखाया गया) का कारण बना।इन आंकड़ों के आधार पर, हम संकेत कर सकते हैं कि BV2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम ग्लियोमा सेल प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
ट्यूमर के विकास पर टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के प्रभाव की जांच करने के लिए, हमने एक्सनोग्राफ़्ट मॉडल के लिए नग्न चूहों में यू87 ग्लियोमा कोशिकाओं को इंजेक्ट किया और बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम या आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम इंजेक्ट किए।1 सप्ताह के बाद ट्यूमर स्पष्ट होने के बाद, 5 चूहों के प्रत्येक प्रायोगिक समूह को ट्यूमर के आकार के अनुसार उसी शुरुआती बिंदु को निर्धारित करने के लिए विभाजित किया गया था, और ट्यूमर के आकार को 22 दिनों के लिए मापा गया था।
U87 xenograft मॉडल वाले चूहों में, 22 दिन में BV2-व्युत्पन्न आरएच-संक्रमित एक्सोसोम समूह में काफी बड़ा ट्यूमर आकार और वजन देखा गया (चित्र 3ए, बी)।दूसरी ओर, बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम समूह और एक्सोसोम उपचार के बाद नियंत्रण समूह के बीच ट्यूमर के आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।इसके अलावा, ग्लियोमा कोशिकाओं और एक्सोसोम के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों ने नेत्रहीन रूप से आरएच-संक्रमित बीवी 2-व्युत्पन्न एक्सोसोम (छवि 3 सी) के समूह में सबसे बड़ा ट्यूमर वॉल्यूम प्रदर्शित किया।इन परिणामों से पता चलता है कि BV2-व्युत्पन्न टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम माउस ट्यूमर मॉडल में ग्लियोमा वृद्धि को प्रेरित करते हैं।
U87 xenograft माउस मॉडल में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम का ऑन्कोजेनेसिस (AC)।बीवी2 से प्राप्त आरएच-संक्रमित एक्सोसोम के साथ इलाज किए गए बीएएलबी/सी नग्न चूहों में ट्यूमर आकार (ए) और वजन (बी) में काफी वृद्धि हुई थी।BALB/c नग्न चूहों (C) को Matrigel मिश्रण में निलंबित 1 x 107 U87 कोशिकाओं के साथ सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था।इंजेक्शन के छह दिन बाद, चूहों में BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के 100 माइक्रोग्राम का इलाज किया गया।ट्यूमर के आकार और वजन को क्रमशः संकेतित दिनों और बलिदान के बाद मापा गया। *पी <0.05। *पी <0.05। *पी <0,05। *पी <0.05। *पी <0.05। *पी <0.05। *पी <0,05। *पी <0.05।
डेटा से पता चला है कि टोक्सोप्लाज्मा आरएच स्ट्रेन (छवि 4 ए) के संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा या ट्यूमर के विकास से जुड़े 37 miRNAs (16 ओवरएक्सप्रेस्ड और 21 डाउनएक्सप्रेस्ड) को माइक्रोग्लिया में महत्वपूर्ण रूप से बदल दिया गया था।परिवर्तित miRNAs के बीच miR-21 के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों की पुष्टि BV2 से प्राप्त एक्सोसोम में वास्तविक समय RT-PCR द्वारा की गई थी, BV2 और U87 कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए एक्सोसोम।MiR-21 की अभिव्यक्ति ने टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (आरएच स्ट्रेन) (चित्र। 4 बी) से संक्रमित बीवी 2 कोशिकाओं से एक्सोसोम में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई।BV2 और U87 कोशिकाओं में miR-21 की सापेक्ष अभिव्यक्ति का स्तर परिवर्तित एक्सोसोम (चित्र। 4B) के तेज होने के बाद बढ़ा।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (ME49 स्ट्रेन) से संक्रमित ट्यूमर रोगियों और चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों में miR-21 अभिव्यक्ति के सापेक्ष स्तर क्रमशः नियंत्रण से अधिक थे (चित्र 4C)।ये परिणाम इन विट्रो और विवो में अनुमानित और पुष्टि किए गए माइक्रोआरएनए के अभिव्यक्ति स्तरों के बीच अंतर के साथ संबंधित हैं।
टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (आरएच) से संक्रमित माइक्रोग्लिया में एक्सोसोमल एमआईपी-21ए-5पी की अभिव्यक्ति में परिवर्तन।(ए) टी गोंडी आरएच संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा या ट्यूमर के विकास से जुड़े siRNA में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रदर्शित करता है।( बी ) बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम, बीवी2-उपचारित एक्सोसोम और यू87 कोशिकाओं में वास्तविक समय आरटी-पीसीआर द्वारा सापेक्ष एमआईआर-21 अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाया गया था।(सी) रिश्तेदार miR-21 अभिव्यक्ति के स्तर ट्यूमर रोगियों (एन = 3) के मस्तिष्क के ऊतकों और टोक्सोप्लाज्मा गोंडी (एमई49 तनाव) (एन = 3) से संक्रमित चूहों में पाए गए थे। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी- टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। *पी <0.05 通过学生t 检验获得। *पी <0.05 * पी <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
आरएच-संक्रमित बीवी2 कोशिकाओं के एक्सोसोम से विवो और इन विट्रो में ग्लिओमास की वृद्धि हुई (चित्र 2, 3)।प्रासंगिक mRNAs का पता लगाने के लिए, हमने BV2 या RH BV2 से प्राप्त एक्सोसोम से संक्रमित U87 कोशिकाओं में एंटीट्यूमर टारगेट जीन, फोर्कहेड बॉक्स O1 (FoxO1), PTEN, और प्रोग्राम्ड सेल डेथ 4 (PDCD4) के mRNA स्तर की जांच की।जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से पता चला है कि कई ट्यूमर से जुड़े जीन, जिनमें फॉक्सओ1, पीटीईएन और पीडीसीडी4 जीन शामिल हैं, में एमआईआर-2121,22 बाध्यकारी साइटें हैं।बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम (चित्र। 5ए) की तुलना में आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम में एंटीट्यूमर लक्ष्य जीन के एमआरएनए स्तर कम हो गए थे।फॉक्सओ1 ने बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम(चित्रा 5बी)की तुलना में आरएच-संक्रमित बीवी2-व्युत्पन्न एक्सोसोम में प्रोटीन के स्तर को कम दिखाया।इन परिणामों के आधार पर, हम पुष्टि कर सकते हैं कि आरएच-संक्रमित बीवी 2 से प्राप्त एक्सोसोम ट्यूमर के विकास में अपनी भूमिका को बनाए रखते हुए एंटी-ऑन्कोजेनिक जीन को डाउनग्रेड करते हैं।
Toxoplasma RH- संक्रमित BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम, Toxoplasma RH- संक्रमित BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम द्वारा U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में एंटीट्यूमर जीन के दमन को प्रेरित करते हैं।( ए ) पीबीएस एक्सोसोम की तुलना में टी। गोंडी आरएच-संक्रमित बीवी 2 से प्राप्त एक्सोसोम में फॉक्सओ 1, पीटीईएन और पीडीसीडी4 अभिव्यक्ति का वास्तविक समय पीसीआर।नियंत्रण के रूप में β-actin mRNA का उपयोग किया गया था।( बी ) फॉक्सओ 1 एक्सप्रेशन वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा निर्धारित किया गया था और इमेजजे प्रोग्राम का उपयोग करके डेन्सिटोमेट्री डेटा का सांख्यिकीय मूल्यांकन किया गया था। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। * पी <0.05 छात्र के टी टेस्ट द्वारा प्राप्त किया गया था। *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी- टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। *पी <0.05 通过学生t 检验获得। *पी <0.05 * पी <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * पी <0.05 छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
ट्यूमर से जुड़े जीन विनियमन पर एक्सोसोम में miP-21 के प्रभाव को समझने के लिए, U87 कोशिकाओं को MiP-21 के एक अवरोधक के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्शन के 24 घंटे बाद काटा गया था।miR-21 अवरोधकों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए कोशिकाओं में FoxO1 और p27 अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना qRT-PCR (चित्र 6A, B) का उपयोग करके BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम के साथ इलाज की गई कोशिकाओं से की गई थी।U87 कोशिकाओं में miR-21 अवरोधक के संक्रमण ने FoxO1 और p27 अभिव्यक्ति (FIG। 6) को काफी कम कर दिया।
U87 ग्लियोमा कोशिकाओं में RH- संक्रमित एक्सोसोमल BV2-व्युत्पन्न miP-21 परिवर्तित FoxO1 / p27 अभिव्यक्ति।U87 कोशिकाओं को लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके miP-21 अवरोधक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और ट्रांसफ़ेक्शन के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को काटा गया था।miR-21 अवरोधकों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए कोशिकाओं में FoxO1 और p27 अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना qRT-PCR (A, B) का उपयोग करके BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम से उपचारित कोशिकाओं के स्तर से की गई थी।
मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने के लिए, टोक्सोप्लाज्मा परजीवी एक ऊतक पुटी में बदल जाता है।वे मेजबान के पूरे जीवनकाल में मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों सहित विभिन्न ऊतकों पर परजीवीकरण करते हैं और मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करते हैं।इसके अलावा, वे मेजबान कोशिकाओं के सेल चक्र और एपोप्टोसिस को विनियमित कर सकते हैं, उनके प्रसार को बढ़ावा दे सकते हैं।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी मुख्य रूप से मस्तिष्क माइक्रोग्लिया सहित मेजबान डेंड्राइटिक कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट / मैक्रोफेज वंश को संक्रमित करता है।टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एम 2 फेनोटाइप के मैक्रोफेज के विभेदन को प्रेरित करता है, रोगज़नक़ संक्रमण के बाद घाव भरने को प्रभावित करता है, और हाइपरवास्कुलराइज़ेशन और ग्रैनुलोमेटस फाइब्रोसिस से भी जुड़ा होता है।टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण का यह व्यवहार रोगजनन ट्यूमर के विकास से जुड़े मार्करों से संबंधित हो सकता है।टोक्सोप्लाज्मा द्वारा विनियमित शत्रुतापूर्ण वातावरण संबंधित पूर्ववर्ती के समान हो सकता है।इसलिए, यह माना जा सकता है कि टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण को ब्रेन ट्यूमर के विकास में योगदान देना चाहिए।वास्तव में, विभिन्न ब्रेन ट्यूमर वाले रोगियों के सीरम में टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण की उच्च दर बताई गई है।इसके अलावा, टोक्सोप्लाज्मा गोंडी एक अन्य कार्सिनोजेनिक प्रभावकारक हो सकता है और अन्य संक्रामक कार्सिनोजेन्स को ब्रेन ट्यूमर विकसित करने में मदद करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से कार्य करता है।इस संबंध में, यह ध्यान देने योग्य है कि पी। फाल्सीपेरम और एपस्टीन-बार वायरस सहक्रियात्मक रूप से बर्किट के लिंफोमा के गठन में योगदान करते हैं।
कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में नियामकों के रूप में एक्सोसोम की भूमिका की बड़े पैमाने पर जांच की गई है।हालांकि, परजीवियों और संक्रमित मेजबानों के बीच एक्सोसोम की भूमिका खराब समझी जाती है।अब तक, गुप्त प्रोटीन सहित विभिन्न नियामकों ने उन जैविक प्रक्रियाओं की व्याख्या की है जिनके द्वारा प्रोटोजोआ परजीवी मेजबान हमले का विरोध करते हैं और संक्रमण को कायम रखते हैं।हाल ही में, एक बढ़ती हुई अवधारणा रही है कि प्रोटोजोआ से जुड़े माइक्रोवेसिकल्स और उनके माइक्रोआरएनए अपने अस्तित्व के लिए अनुकूल वातावरण बनाने के लिए मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं।इसलिए, परिवर्तित एक्सोसोमल miRNAs और ग्लियोमा सेल प्रसार के बीच संबंधों की खोज के लिए और अध्ययन की आवश्यकता है।माइक्रोआरएनए परिवर्तन (क्लस्टर जीन miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 और miR-17-92) टॉक्सोप्लाज्मा-संक्रमित मानव मैक्रोफेज में STAT3 प्रमोटर को बांधता है, विनियमित और विरोधी प्रेरित करता है टोक्सोप्लाज्मा गोंडी संक्रमण के जवाब में एपोप्टोसिस 29।Toxoplasma संक्रमण miR-17-5p और miR-106b-5p की अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जो कई हाइपरप्रोलिफेरेटिव रोगों 30 से जुड़े हैं।ये आंकड़े बताते हैं कि टॉक्सोप्लाज्मा संक्रमण द्वारा विनियमित मेजबान miRNAs मेजबान जैविक व्यवहार में परजीवी अस्तित्व और रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण अणु हैं।
परिवर्तित miRNAs घातक कोशिकाओं की दीक्षा और प्रगति के दौरान विभिन्न प्रकार के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें ग्लिओमास शामिल हैं: विकास संकेतों की आत्मनिर्भरता, विकास-अवरोधक संकेतों के प्रति असंवेदनशीलता, एपोप्टोसिस चोरी, असीमित प्रतिकृति क्षमता, एंजियोजेनेसिस, आक्रमण और मेटास्टेसिस, और सूजन।ग्लियोमा में, कई अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग अध्ययनों में परिवर्तित miRNAs की पहचान की गई है।
वर्तमान अध्ययन में, हमने टॉक्सोप्लाज्मा-संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में miRNA-21 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर की पुष्टि की।miR-21 की पहचान ग्लियोमास, 33 सहित ठोस ट्यूमर में सबसे अधिक बार-बार अतिप्रवाहित माइक्रोआरएनए में से एक के रूप में की गई है और इसकी अभिव्यक्ति ग्लियोमा के ग्रेड के साथ संबंधित है।संचित साक्ष्य बताते हैं कि miR-21 एक उपन्यास ऑन्कोजीन है जो ग्लियोमा वृद्धि में एक एंटी-एपोप्टोटिक कारक के रूप में कार्य करता है और मानव मस्तिष्क की विकृतियों के ऊतकों और प्लाज्मा में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है।दिलचस्प बात यह है कि ग्लियोमा कोशिकाओं और ऊतकों में miR-21 निष्क्रियता कैसपेज़-आश्रित एपोप्टोसिस के कारण कोशिका प्रसार के निषेध को ट्रिगर करती है।MiR-21 के पूर्वानुमानित लक्ष्यों के जैव सूचनात्मक विश्लेषण से पता चला है कि miR-2121 बाइंडिंग साइट के साथ प्रोग्राम्ड सेल डेथ 4 (PDCD4), ट्रोपोमायोसिन (TPM1), PTEN, और फोर्कहेड बॉक्स O1 (FoxO1) सहित एपोप्टोसिस पाथवे से जुड़े कई ट्यूमर शमन जीन हैं।.22.38।
फॉक्सओ1, ट्रांसक्रिप्शन कारकों (फॉक्सो) में से एक के रूप में, विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर के विकास में शामिल है और ट्यूमर शमन जीन जैसे कि पी21, पी27, बिम और एफएएसएल40 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकता है।फॉक्सओ1 सेल विकास को दबाने के लिए पी27 जैसे सेल चक्र अवरोधकों को बाँध और सक्रिय कर सकता है।इसके अलावा, FoxO1 PI3K / Akt सिग्नलिंग का एक प्रमुख प्रभावकारक है और P2742 ट्रांसक्रिप्शन सक्रियण के माध्यम से सेल चक्र प्रगति और सेल भेदभाव जैसी कई जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है।
अंत में, हम मानते हैं कि टोक्सोप्लाज्मा-संक्रमित माइक्रोग्लिया से प्राप्त एक्सोसोमल miR-21 ग्लियोमा कोशिकाओं (चित्र 7) के विकास नियामक के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।हालाँकि, एक्सोसोमल miR-21, परिवर्तित टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण और ग्लियोमा वृद्धि के बीच सीधा संबंध खोजने के लिए और अध्ययन की आवश्यकता है।इन परिणामों से टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण और ग्लियोमा की घटनाओं के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करने की उम्मीद है।
इस अध्ययन में ग्लियोमा (मस्तिष्क) कार्सिनोजेनेसिस के तंत्र का एक योजनाबद्ध आरेख प्रस्तावित है।लेखक PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA) में आरेखित करता है।
इस अध्ययन में सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल, जानवरों के उपयोग सहित, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी एनिमल केयर एंड यूजर कमेटी स्टैंडर्ड एथिकल गाइडलाइंस के अनुसार थे और सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (IRB नंबर SNU-) के इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित थे। 150715)।-2).सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं ARRIVE सिफारिशों के अनुसार की गईं।
BV2 माउस माइक्रोग्लिया और U87 मानव ग्लियोमा कोशिकाओं को क्रमशः Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM; Welgene, सियोल, कोरिया) और Roswell Park मेमोरियल इंस्टीट्यूट के मीडियम (RPMI; Welgene) में संवर्धित किया गया था, जिनमें से प्रत्येक में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 mM l- था। ग्लूटामाइन, 0.2 मिमी पेनिसिलिन और 0.05 मिमी स्ट्रेप्टोमाइसिन।37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था।एक अन्य ग्लियोमा सेल लाइन, U118, का उपयोग U87 कोशिकाओं के साथ तुलना के लिए किया गया था।
टी. गोंडी-संक्रमित आरएच और एमई49 उपभेदों से एक्सोसोम को अलग करने के लिए, टी. गोंडी टैचीज़ोइट्स (आरएच तनाव) को 3-4 दिन पहले इंजेक्ट किए गए 6-सप्ताह पुराने बीएएलबी/सी चूहों के उदर गुहा से काटा गया था।Tachyzoites को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और 40% Percoll (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया।स्ट्रेन ME49 के टैचीज़ोइट्स प्राप्त करने के लिए, BALB/c चूहों को 20 टिश्यू सिस्ट के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था और सिस्ट में टैचीज़ोइट परिवर्तन संक्रमण (PI) के बाद 6-8 वें दिन उदर गुहा को धोकर एकत्र किया गया था।पीबीएस से संक्रमित चूहे।ME49 tachyzoites 100 μg / ml पेनिसिलिन (गिब्को / BRL, ग्रैंड आइलैंड, NY, USA), 100 μg / ml स्ट्रेप्टोमाइसिन (गिब्को / BRL), और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (लोन्ज़ा, वॉकर्सविले, एमडी) के साथ पूरक कोशिकाओं में उगाए गए थे। .., यूएसए) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर।वेरो कोशिकाओं में खेती के बाद, मलबे और कोशिकाओं को हटाने के लिए ME49 tachyzoites को 25 गेज सुई के माध्यम से दो बार और फिर 5 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया।धोने के बाद, पीबीएस 44 में टैचीज़ोइट्स को फिर से जोड़ा गया।Toxoplasma gondii स्ट्रेन ME49 के ऊतक अल्सर को संक्रमित C57BL/6 चूहों (ओरिएंट बायो एनिमल सेंटर, सेन्गनाम, कोरिया) के मस्तिष्क से पृथक अल्सर के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बनाए रखा गया था।ME49-संक्रमित चूहों के दिमाग को 3 महीने के PI के बाद काटा गया और अल्सर को अलग करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे कीमा बनाया गया।सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में संक्रमित चूहों को विशेष रोग-मुक्त परिस्थितियों (एसपीएफ) के तहत रखा गया था।
निर्माता के निर्देशों के अनुसार miRNeasy मिनी किट (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम, BV2 कोशिकाओं और ऊतकों से कुल RNA निकाला गया, जिसमें क्षालन चरण के लिए ऊष्मायन समय भी शामिल है।RNA सांद्रता एक NanoDrop 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर निर्धारित की गई थी।Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, नीदरलैंड) का उपयोग करके RNA माइक्रोएरे की गुणवत्ता का आकलन किया गया था।
10% एक्सोसोम-खराब एफबीएस के साथ डीएमईएम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 100,000 ग्राम पर 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार किया गया था और 0.22 माइक्रोन फिल्टर (नलगीन, रोचेस्टर, एनवाई, यूएसए) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था।BV2 कोशिकाओं, 5 × 105, DMEM में सुसंस्कृत थे जिसमें 10% एक्सोसोम-घटित FBS और 1% एंटीबायोटिक्स 37 ° C और 5% CO2 थे।ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, तनाव आरएच या एमई49 (एमओआई = 10) के टैचीज़ोइट्स को कोशिकाओं में जोड़ा गया और गैर-हमलावर परजीवी एक घंटे के भीतर हटा दिए गए और डीएमईएम से भर दिया गया।BV2 कोशिकाओं से एक्सोसोम को संशोधित अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था, जो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है।आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए 300 μl पीबीएस में exosome गोली Resuspend।पृथक एक्सोसोम की सांद्रता एक बीसीए प्रोटीन परख किट (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए) और एक नैनोड्रॉप 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।
BV2 कोशिकाओं या BV2 से प्राप्त एक्सोसोम को PRO-PREP ™ प्रोटीन निष्कर्षण समाधान (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) में lysed किया गया था और Coomassie शानदार नीले दाग वाले 10% SDS पॉलीएक्रिलामाइड जैल पर प्रोटीन लोड किए गए थे।इसके अलावा, प्रोटीन को 2 घंटे के लिए पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया।एक्सोसोमल मार्कर के रूप में एलिक्स एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, बेवर्ली, एमए, यूएसए) का उपयोग करके पश्चिमी धमाकों को मान्य किया गया था।HRP-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस IgG (H + L) (बेथिल लेबोरेटरीज, मोंटगोमरी, TX, USA) और एक LAS-1000 प्लस ल्यूमिनेसेंट इमेज एनालाइज़र (फ़ूजी फ़ोटोग्राफ़िक फ़िल्म, टोक्यो, जापान) को द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में उपयोग किया गया था।.एक्सोसोम के आकार और आकारिकी का अध्ययन करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया।बीवी 2 कोशिकाओं (6.40 μg / μl) से अलग किए गए एक्सोसोम कार्बन-लेपित मेश पर तैयार किए गए थे और 1 मिनट के लिए 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक रूप से दागे गए थे।तैयार नमूनों को ES1000W Erlangshen CCD कैमरा (Gatan, Pleasanton, CA, USA) से लैस JEOL 1200-EX II (टोक्यो, जापान) का उपयोग करते हुए 80 kV के त्वरित वोल्टेज पर देखा गया।
कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए PKH26 रेड फ्लोरेसेंट लिंकर किट (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके BV2-व्युत्पन्न एक्सोसोम को दाग दिया गया।U87 कोशिकाएं, 2 × 105, PKH26-लेबल वाले एक्सोसोम (लाल) या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई एक्सोसोम नहीं, 5% CO2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था।U87 सेल नाभिक को DAPI (नीला) के साथ दाग दिया गया था, U87 कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 15 मिनट के लिए 4 ° C पर तय किया गया था और फिर एक Leica TCS SP8 STED CW कन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम (Leica माइक्रोसिस्टम्स, मैनहेम, जर्मनी) में विश्लेषण किया गया था।देखने योग्य।
cDNA को Mir-X siRNA पहले स्ट्रैंड सिंथेसिस और SYBR qRT-PCR किट (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) का उपयोग करके siRNA से संश्लेषित किया गया था।SYBR Premix के साथ मिश्रित प्राइमरों और टेम्प्लेट का उपयोग करके iQ5 रीयल टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था।डीएनए को 15 एस के लिए 9 5 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 40 चक्रों के लिए प्रवर्धित किया गया था और 60 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग किया गया था।आईक्यू ™ 5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर (बायो-रेड) के डेटा विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करके प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के डेटा का विश्लेषण किया गया था।चयनित लक्ष्य जीनों और β-actin/siRNA (और U6) के बीच जीन अभिव्यक्ति में सापेक्ष परिवर्तनों की गणना मानक वक्र विधि का उपयोग करके की गई थी।उपयोग किए गए प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में दिखाए गए हैं।
3 x 104 U87 ग्लियोमा कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में बीज दिया गया था और बीवी2 (50 μg/mL) या बीवी2 (50 μg/mL) से प्राप्त नॉनपल्स एक्सोसोम से प्राप्त टॉक्सोप्लाज्मा-संक्रमित एक्सोसोम के साथ 12, 18 और 36 घंटे पर नियंत्रण के रूप में मिलाया गया था। .सेल प्रसार दर सेल काउंटिंग किट-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (अनुपूरक आंकड़े S1-S3) 46 का उपयोग करके निर्धारित की गई थी।
5-सप्ताह की मादा BALB / c नग्न चूहों को ओरिएंट बायो (सियोंगनाम-सी, दक्षिण कोरिया) से खरीदा गया था और कमरे के तापमान (22 ± 2 ° C) और आर्द्रता (45 ± 15 ° C) पर व्यक्तिगत रूप से बाँझ पिंजरों में रखा गया था।%) कमरे के तापमान (22±2°C) और आर्द्रता (45±15%) पर।एसपीएफ (सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन एनिमल सेंटर) के तहत 12 घंटे का प्रकाश चक्र और 12 घंटे का अंधेरा चक्र किया गया।चूहे को बेतरतीब ढंग से 5 चूहों के तीन समूहों में विभाजित किया गया था और सभी समूहों को पीबीएस के 400 मिलीलीटर के साथ सूक्ष्म रूप से इंजेक्ट किया गया था जिसमें 1 x 107 U87 ग्लियोमा कोशिकाएं थीं और विकास कारक बीडी मैट्रीगेल ™ (बीडी साइंस, मियामी, एफएल, यूएसए) को कम कर दिया था।ट्यूमर इंजेक्शन के छह दिन बाद, BV2 कोशिकाओं (टोक्सोप्लाज्मा संक्रमण के साथ / बिना) से प्राप्त 200 मिलीग्राम एक्सोसोम को ट्यूमर साइट में इंजेक्ट किया गया।ट्यूमर के संक्रमण के बाईस दिन बाद, प्रत्येक समूह में चूहों के ट्यूमर के आकार को सप्ताह में तीन बार कैलीपर से मापा जाता था, और ट्यूमर की मात्रा की गणना सूत्र द्वारा की जाती थी: 0.5 × (चौड़ाई) × 2 × लंबाई।
माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण miRCURYTM LNA miRNA सरणी, 7वीं पीढ़ी है, mmu और rno सरणी (EXIQON, Vedbaek, डेनमार्क) का उपयोग करके 3100 मानव, माउस और चूहे miRNA कैप्चर प्रोब के बीच 1119 अच्छी तरह से चित्रित चूहों को कवर करता है।इस प्रक्रिया के दौरान, कुल आरएनए के 250 से 1000 एनजी को 5′-फॉस्फेट से बछड़ा आंतों के क्षारीय फॉस्फेट के साथ उपचार द्वारा हटा दिया गया था, जिसके बाद Hy3 हरी फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग की गई थी।तब लेबल किए गए नमूनों को एक संकरण कक्ष किट (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) और एक संकरण स्लाइड किट (Agilent Technologies) का उपयोग करके माइक्रोएरे स्लाइड लोड करके संकरणित किया गया था।56 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए संकरण किया गया, फिर निर्माता की सिफारिशों के अनुसार माइक्रोएरे धोए गए।संसाधित माइक्रोएरे स्लाइड्स को तब Agilent G2565CA माइक्रोएरे स्कैनर सिस्टम (Agilent Technologies) का उपयोग करके स्कैन किया गया था।स्कैन की गई छवियों को Agilent फ़ीचर एक्सट्रैक्शन सॉफ़्टवेयर संस्करण 10.7.3.1 (Agilent Technologies) का उपयोग करके आयात किया गया था और प्रत्येक छवि की प्रतिदीप्ति तीव्रता को संशोधित Exiqon प्रोटोकॉल की संबंधित GAL फ़ाइल का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।वर्तमान अध्ययन के लिए माइक्रोएरे डेटा GEO डेटाबेस में परिग्रहण संख्या GPL32397 के तहत जमा किए गए हैं।
Toxoplasma से संक्रमित RH या ME49 उपभेदों के माइक्रोग्लिया में परिपक्व एक्सोसोमल miRNAs के अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विभिन्न नेटवर्क उपकरणों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।ट्यूमर के विकास से जुड़े miRNAs को miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) का उपयोग करके पहचाना गया और 8.0 से अधिक सामान्यीकृत सिग्नल तीव्रता (log2) के साथ फ़िल्टर किया गया।MiRNAs के बीच, भिन्न रूप से व्यक्त miRNAs को T. गोंडी से संक्रमित RH या ME49 उपभेदों द्वारा परिवर्तित miRNAs के फ़िल्टर विश्लेषण द्वारा 1.5 गुना से अधिक परिवर्तित पाया गया।
कोशिकाओं को ऑप्टि-एमईएम (गिब्को, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) में लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (इंविट्रोजेन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके छह-वेल प्लेट्स (3 x 10 सेल/वेल) में सीड किया गया था।ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया और फिर माध्यम को ताज़ा पूर्ण माध्यम में बदल दिया गया।अभिकर्मक के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को काटा गया।
सांख्यिकीय विश्लेषण मुख्य रूप से एक्सेल सॉफ्टवेयर (माइक्रोसॉफ्ट, वाशिंगटन, डीसी, यूएसए) के साथ छात्र के टी- टेस्ट का उपयोग करके किया गया था।प्रायोगिक पशु विश्लेषण के लिए, प्रिज्म 3.0 सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, ला जोला, सीए, यूएसए) का उपयोग करके दो-तरफ़ा एनोवा का प्रदर्शन किया गया। P-मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। P-मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। पी 值< 0.05 被认为具有统计学意义। पी 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P मान <0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।
इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (आईआरबी संख्या एसएनयू-150715-2) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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