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फुफ्फुसीय सिस्टिक फाइब्रोसिस के उपचार के लिए जीन वैक्टर प्रवाहकीय वायुमार्गों को लक्षित किया जाना चाहिए, क्योंकि परिधीय फेफड़े के पारगमन का कोई चिकित्सीय प्रभाव नहीं होता है।वायरल ट्रांसडक्शन की दक्षता सीधे वाहक के निवास समय से संबंधित है।हालांकि, डिलीवरी तरल पदार्थ जैसे कि जीन वाहक अंतःश्वसन के दौरान एल्वियोली में स्वाभाविक रूप से फैल जाते हैं, और म्यूकोसिलरी ट्रांसपोर्ट द्वारा किसी भी आकार के उपचारात्मक कणों को तेजी से हटा दिया जाता है।श्वसन पथ में जीन वाहकों के निवास समय को बढ़ाना महत्वपूर्ण है लेकिन इसे प्राप्त करना कठिन है।वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जिन्हें श्वसन पथ की सतह पर निर्देशित किया जा सकता है, क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण में सुधार कर सकते हैं।विवो इमेजिंग में समस्याओं के कारण, लागू चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में वायुमार्ग की सतह पर ऐसे छोटे चुंबकीय कणों का व्यवहार खराब समझा जाता है।इस अध्ययन का उद्देश्य विवो में एकल और बल्क कणों के व्यवहार की गतिशीलता और पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एनेस्थेटाइज़्ड चूहों के श्वासनली में चुंबकीय कणों की एक श्रृंखला के संचलन की कल्पना करने के लिए सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग का उपयोग करना था।हमने तब यह भी आकलन किया कि क्या चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में लेंटिवायरल चुंबकीय कणों की डिलीवरी से चूहे की श्वासनली में पारगमन की दक्षता में वृद्धि होगी।सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग इन विट्रो और विवो में स्थिर और गतिशील चुंबकीय क्षेत्रों में चुंबकीय कणों के व्यवहार को दर्शाता है।चुम्बकों का उपयोग करके जीवित वायुमार्गों की सतह पर कणों को आसानी से नहीं खींचा जा सकता है, लेकिन परिवहन के दौरान, जमा दृश्य क्षेत्र में केंद्रित होते हैं, जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है।चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में लेंटिवायरल चुंबकीय कणों को वितरित किए जाने पर पारगमन क्षमता भी छह गुना बढ़ गई थी।एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि विवो में प्रवाहकीय वायुमार्ग में जीन वेक्टर लक्ष्यीकरण और पारगमन स्तर में सुधार के लिए लेंटीवायरल चुंबकीय कण और चुंबकीय क्षेत्र मूल्यवान दृष्टिकोण हो सकते हैं।
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) CF ट्रांसमेम्ब्रेन कंडक्टर रेगुलेटर (CFTR) नामक एकल जीन में भिन्नता के कारण होता है।CFTR प्रोटीन एक आयन चैनल है जो पूरे शरीर में कई उपकला कोशिकाओं में मौजूद होता है, जिसमें वायुमार्ग भी शामिल है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस के रोगजनन में एक प्रमुख स्थल है।सीएफटीआर में दोष असामान्य जल परिवहन, वायुमार्ग की सतह के निर्जलीकरण और वायुमार्ग की सतह द्रव परत (एएसएल) की गहराई को कम करते हैं।यह साँस के कणों और रोगजनकों के वायुमार्ग को साफ़ करने के लिए म्यूकोसिलरी ट्रांसपोर्ट (MCT) प्रणाली की क्षमता को भी बाधित करता है।हमारा लक्ष्य सीएफटीआर जीन की सही प्रति देने और एएसएल, एमसीटी और फेफड़ों के स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए एक लेंटिवायरल (एलवी) जीन थेरेपी विकसित करना है, और ऐसी नई तकनीकों को विकसित करना जारी रखना है जो इन मापदंडों को वीवो1 में माप सकें।
एलवी वैक्टर सिस्टिक फाइब्रोसिस जीन थेरेपी के लिए अग्रणी उम्मीदवारों में से एक हैं, मुख्यतः क्योंकि वे चिकित्सीय जीन को वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं (वायुमार्ग स्टेम सेल) में स्थायी रूप से एकीकृत कर सकते हैं।यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वे सिस्टिक फाइब्रोसिस से जुड़े कार्यात्मक जीन-संशोधित वायुमार्ग सतह कोशिकाओं में अंतर करके सामान्य जलयोजन और बलगम निकासी को बहाल कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आजीवन लाभ होता है।एलवी वैक्टर को प्रवाहकीय वायुमार्ग के खिलाफ निर्देशित किया जाना चाहिए, क्योंकि यहीं से सीएफ में फेफड़े की भागीदारी शुरू होती है।वेक्टर के फेफड़े में गहराई तक जाने से वायुकोशीय पारगमन हो सकता है, लेकिन सिस्टिक फाइब्रोसिस में इसका कोई उपचारात्मक प्रभाव नहीं है।हालांकि, जीन वाहक जैसे तरल पदार्थ स्वाभाविक रूप से एल्वियोली में चले जाते हैं जब बच्चे के जन्म के बाद 3,4 और चिकित्सीय कणों को एमसीटी द्वारा मौखिक गुहा में तेजी से निष्कासित कर दिया जाता है।एलवी ट्रांसडक्शन की दक्षता सीधे तौर पर उस समय से संबंधित है जब वेक्टर सेलुलर अपटेक की अनुमति देने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के करीब रहता है - "निवास समय" 5 जिसे विशिष्ट क्षेत्रीय एयरफ्लो के साथ-साथ बलगम और एमसीटी कणों के समन्वित तेज द्वारा आसानी से छोटा किया जाता है।सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए, इस क्षेत्र में उच्च स्तर के पारगमन को प्राप्त करने के लिए वायुमार्ग में एलवी निवास समय को लम्बा करने की क्षमता महत्वपूर्ण है, लेकिन अब तक चुनौतीपूर्ण रही है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि LV चुंबकीय कण (MPs) दो पूरक तरीकों से मदद कर सकते हैं।सबसे पहले, उन्हें लक्षित करने में सुधार करने और जीन वाहक कणों को वायुमार्ग के सही क्षेत्र में रहने में मदद करने के लिए वायुमार्ग की सतह पर एक चुंबक द्वारा निर्देशित किया जा सकता है;और एएसएल) सेल परत 6 में चले जाते हैं। एमपी व्यापक रूप से लक्षित दवा वितरण वाहनों के रूप में उपयोग किया जाता है जब वे एंटीबॉडी, कीमोथेरेपी दवाओं, या अन्य छोटे अणुओं से जुड़ते हैं जो कोशिका झिल्ली से जुड़ते हैं या अपने संबंधित सेल सतह रिसेप्टर्स से जुड़ते हैं और ट्यूमर साइटों पर जमा होते हैं। स्थैतिक बिजली की उपस्थिति।कैंसर चिकित्सा के लिए चुंबकीय क्षेत्र 7. अन्य "हाइपरथर्मिक" विधियों का उद्देश्य दोलनशील चुंबकीय क्षेत्रों के संपर्क में आने पर एमपी को गर्म करके ट्यूमर कोशिकाओं को मारना है।चुंबकीय अभिकर्मक का सिद्धांत, जिसमें कोशिकाओं में डीएनए के हस्तांतरण को बढ़ाने के लिए ट्रांसफ़ेक्शन एजेंट के रूप में एक चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग किया जाता है, आमतौर पर मुश्किल-से-ट्रांसड्यूस सेल लाइनों के लिए गैर-वायरल और वायरल जीन वैक्टर की एक श्रृंखला का उपयोग करके इन विट्रो में उपयोग किया जाता है। ..एक स्थिर चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में मानव ब्रोन्कियल उपकला की एक सेल लाइन में इन विट्रो में एलवी एमपी की डिलीवरी के साथ एलवी मैग्नेटोट्रांसफेक्शन की दक्षता स्थापित की गई थी, अकेले एलवी वेक्टर की तुलना में ट्रांसडक्शन की दक्षता 186 गुना बढ़ गई थी।एलवी एमटी को सिस्टिक फाइब्रोसिस के इन विट्रो मॉडल पर भी लागू किया गया है, जहां चुंबकीय ट्रांसफेक्शन ने सिस्टिक फाइब्रोसिस स्पुतम की उपस्थिति में 20 के एक कारक द्वारा एयर-लिक्विड इंटरफेस कल्चर में एलवी ट्रांसडक्शन को बढ़ाया।हालांकि, विवो ऑर्गन मैग्नेटोट्रांसफेक्शन में अपेक्षाकृत कम ध्यान दिया गया है और केवल कुछ जानवरों के अध्ययन11,12,13,14,15 में मूल्यांकन किया गया है, विशेष रूप से फेफड़ों16,17 में।हालांकि, सिस्टिक फाइब्रोसिस में फेफड़े के उपचार में चुंबकीय संक्रमण की संभावनाएं स्पष्ट हैं।टैन एट अल।(2020) ने कहा कि "चुंबकीय नैनोकणों के प्रभावी पल्मोनरी डिलीवरी पर एक सत्यापन अध्ययन सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले रोगियों में नैदानिक ​​​​परिणामों में सुधार के लिए भविष्य की सीएफटीआर इनहेलेशन रणनीतियों का मार्ग प्रशस्त करेगा"6।
अनुप्रयुक्त चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में श्वसन मार्ग की सतह पर छोटे चुंबकीय कणों के व्यवहार की कल्पना करना और अध्ययन करना कठिन है, और इसलिए उन्हें कम समझा जाता है।अन्य अध्ययनों में, हमने गैर-इनवेसिव इमेजिंग के लिए एक सिंक्रोट्रॉन प्रचार आधारित चरण कंट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (पीबी-पीसीएक्सआई) विधि विकसित की है और एएसएल18 गहराई और एमसीटी19 व्यवहार में विवो परिवर्तनों में मिनटों की मात्रा का ठहराव, सीधे गैस चैनल सतह जलयोजन को मापने के लिए20 और एक प्रारंभिक संकेतक उपचार प्रभावशीलता के रूप में प्रयोग किया जाता है।इसके अलावा, हमारी एमसीटी स्कोरिंग विधि एल्यूमिना या उच्च अपवर्तक सूचकांक ग्लास से बने 10-35 माइक्रोन व्यास के कणों का उपयोग करती है क्योंकि पीबी-पीसीएक्सआई21 के साथ एमसीटी मार्कर दिखाई देते हैं।दोनों विधियाँ MPs सहित कई प्रकार के कण प्रकारों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं।
उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के कारण, हमारे पीबी-पीसीएक्सआई-आधारित एएसएल और एमसीटी परख वीवो में एकल और बल्क कणों की गतिशीलता और व्यवहार पैटर्न का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं ताकि हमें एमपी जीन वितरण विधियों को समझने और अनुकूलित करने में मदद मिल सके।हम यहां जिस दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं, वह SPring-8 BL20B2 बीमलाइन का उपयोग करते हुए हमारे अध्ययन पर आधारित है, जिसमें हमने अपने विषम जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को समझाने में मदद करने के लिए चूहों के नाक और फुफ्फुसीय वायुमार्ग में डमी वेक्टर की एक खुराक के वितरण के बाद द्रव आंदोलन की कल्पना की। हमारे जीन में।3.4 की वाहक खुराक के साथ पशु अध्ययन।
इस अध्ययन का उद्देश्य जीवित चूहों के श्वासनली में सांसदों की एक श्रृंखला के विवो आंदोलनों में कल्पना करने के लिए पीबी-पीसीएक्सआई सिंक्रोट्रॉन का उपयोग करना था।इन पीबी-पीसीएक्सआई इमेजिंग अध्ययनों को एमपी श्रृंखला, चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और एमपी आंदोलन पर उनके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए स्थान का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।हमने माना कि एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र वितरित एमएफ को रहने या लक्ष्य क्षेत्र में जाने में मदद करेगा।इन अध्ययनों ने हमें चुंबक विन्यासों को निर्धारित करने की भी अनुमति दी है जो बयान के बाद श्वासनली में छोड़े गए कणों की मात्रा को अधिकतम करते हैं।अध्ययनों की एक दूसरी श्रृंखला में, हमने इस इष्टतम विन्यास का उपयोग चूहे के वायुमार्गों को LV-MPs की विवो डिलीवरी से उत्पन्न पारगमन पैटर्न को प्रदर्शित करने के लिए किया था, इस धारणा पर कि LV-MPs की डिलीवरी वायुमार्ग लक्ष्यीकरण के संदर्भ में होगी। बढ़ी हुई एलवी ट्रांसडक्शन दक्षता में।.
एडिलेड विश्वविद्यालय (M-2019-060 और M-2020-022) और SPring-8 सिंक्रोट्रॉन एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सभी पशु अध्ययन किए गए थे।प्रयोग आगमन की सिफारिशों के अनुसार किए गए थे।
सभी एक्स-रे छवियों को जापान में SPring-8 सिंक्रोट्रॉन में BL20XU बीमलाइन पर लिया गया था, जो कि पहले वर्णित के समान सेटअप का उपयोग कर रहा था।संक्षेप में, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंग से 245 मीटर की दूरी पर स्थित था।कण इमेजिंग अध्ययन के लिए 0.6 मीटर की एक नमूना-से-डिटेक्टर दूरी का उपयोग किया जाता है और चरण विपरीत प्रभाव बनाने के लिए विवो इमेजिंग अध्ययन में 0.3 मीटर का उपयोग किया जाता है।25 केवी की ऊर्जा वाला एक मोनोक्रोमैटिक बीम इस्तेमाल किया गया था।छवियों को एक उच्च रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे ट्रांसड्यूसर (SPring-8 BM3) का उपयोग करके एक sCMOS डिटेक्टर से जोड़ा गया था।ट्रांसड्यूसर एक्स-रे को 10 माइक्रोन मोटे स्किन्टिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) का उपयोग करके दृश्यमान प्रकाश में परिवर्तित करता है, जिसे फिर ×10 (NA 0.3) माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग करके sCMOS सेंसर को निर्देशित किया जाता है।एससीएमओएस डिटेक्टर 2048 × 2048 पिक्सल के सरणी आकार और 6.5 × 6.5 माइक्रोन के कच्चे पिक्सेल आकार के साथ एक ओर्का-फ्लैश 4.0 (हमामत्सू फोटोनिक्स, जापान) था।यह सेटिंग 0.51 µm का प्रभावी आइसोट्रोपिक पिक्सेल आकार और लगभग 1.1 मिमी × 1.1 मिमी का दृश्य क्षेत्र देती है।श्वास के कारण होने वाली गति कलाकृतियों को कम करते हुए वायुमार्ग के अंदर और बाहर चुंबकीय कणों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए 100 एमएस की एक्सपोजर अवधि को चुना गया था।विवो अध्ययनों के लिए, एक्सपोज़र के बीच एक्स-रे बीम को अवरुद्ध करके विकिरण खुराक को सीमित करने के लिए एक्स-रे पथ में एक तेज़ एक्स-रे शटर रखा गया था।
किसी भी SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अध्ययन में LV मीडिया का उपयोग नहीं किया गया था क्योंकि BL20XU इमेजिंग चैंबर बायोसेफ्टी लेवल 2 प्रमाणित नहीं है।इसके बजाय, हमने आकार, सामग्री, लोहे की सांद्रता और अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला को कवर करने वाले दो वाणिज्यिक विक्रेताओं से अच्छी तरह से चित्रित एमपी की एक श्रृंखला का चयन किया - पहले यह समझने के लिए कि चुंबकीय क्षेत्र ग्लास केशिकाओं में एमपी के आंदोलन को कैसे प्रभावित करते हैं, और फिर में जीवित वायुमार्ग।सतह।एमपी का आकार 0.25 से 18 माइक्रोन तक भिन्न होता है और विभिन्न सामग्रियों से बना होता है (तालिका 1 देखें), लेकिन एमपी में चुंबकीय कणों के आकार सहित प्रत्येक नमूने की संरचना अज्ञात है।हमारे व्यापक एमसीटी अध्ययन 19, 20, 21, 23, 24 के आधार पर, हम उम्मीद करते हैं कि 5 माइक्रोन से नीचे के एमपी को श्वासनली वायुमार्ग की सतह पर देखा जा सकता है, उदाहरण के लिए, एमपी आंदोलन की बेहतर दृश्यता देखने के लिए लगातार फ्रेम घटाकर।0.25 माइक्रोन का एक एमपी इमेजिंग डिवाइस के रिज़ॉल्यूशन से छोटा है, लेकिन पीबी-पीसीएक्सआई से उनके वॉल्यूमेट्रिक कंट्रास्ट और सतह के तरल पदार्थ की गति का पता लगाने की उम्मीद है, जिस पर वे जमा होने के बाद जमा होते हैं।
तालिका में प्रत्येक सांसद के लिए नमूने।1 को 0.63 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 20 μl ग्लास केशिकाओं (ड्रमंड माइक्रोकैप्स, पीए, यूएसए) में तैयार किया गया था।कॉर्पसकुलर कण पानी में उपलब्ध होते हैं, जबकि कॉम्बीमैग कण निर्माता के मालिकाना तरल में उपलब्ध होते हैं।प्रत्येक ट्यूब तरल से आधा भरा हुआ है (लगभग 11 μl) और नमूना धारक पर रखा गया है (चित्र 1 देखें)।कांच केशिकाओं को क्रमशः इमेजिंग कक्ष में मंच पर क्षैतिज रूप से रखा गया था, और तरल के किनारों पर तैनात किया गया था।रेअर अर्थ, नियोडिमियम, आयरन और बोरॉन (NdFeB) (N35, कैट नं. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) से बना एक 19 मिमी व्यास (28 मिमी लंबा) निकेल-शेल चुंबक 1.17 T के अवशेष के साथ जुड़ा हुआ था। प्राप्त करने के लिए अलग स्थानांतरण तालिका प्रतिपादन के दौरान दूरस्थ रूप से अपनी स्थिति बदलें।एक्स-रे इमेजिंग तब शुरू होती है जब चुंबक नमूना से लगभग 30 मिमी ऊपर स्थित होता है और छवियों को प्रति सेकंड 4 फ्रेम पर प्राप्त किया जाता है।इमेजिंग के दौरान, चुंबक को कांच की केशिका ट्यूब (लगभग 1 मिमी की दूरी पर) के करीब लाया गया और फिर क्षेत्र की ताकत और स्थिति के प्रभाव का आकलन करने के लिए ट्यूब के साथ ले जाया गया।
एक्सई नमूने के अनुवाद के चरण में ग्लास केशिकाओं में एमपी नमूने युक्त इन विट्रो इमेजिंग सेटअप।एक्स-रे बीम का मार्ग लाल बिंदीदार रेखा से चिह्नित होता है।
एक बार सांसदों की इन विट्रो दृश्यता स्थापित हो जाने के बाद, उनमें से एक सबसेट का विवो में जंगली प्रकार की मादा विस्टार एल्बिनो चूहों (~ 12 सप्ताह पुराना, ~ 200 ग्राम) पर परीक्षण किया गया था।मेडेटोमिडीन 0.24 मिलीग्राम/किग्रा (डोमिटर®, ज़ेनोक, जापान), मिडाज़ोलम 3.2 मिलीग्राम/किग्रा (डोर्मिकम®, एस्टेलस फार्मा, जापान) और ब्यूटोरेफेनॉल 4 मिलीग्राम/किग्रा (वेटोर्फ़ेल®, मीजी सेका)।इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को फार्मा (जापान) मिश्रण के साथ एनेस्थेटाइज किया गया था।संज्ञाहरण के बाद, वे श्वासनली के चारों ओर फर को हटाकर, एक एंडोट्रैचियल ट्यूब (ET; 16 Ga अंतःशिरा प्रवेशनी, टेरुमो बीसीटी) डालकर इमेजिंग के लिए तैयार किए गए थे, और एक थर्मल बैग युक्त कस्टम-मेड इमेजिंग प्लेट पर लापरवाह स्थिति में उन्हें स्थिर कर दिया गया था। शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए।22. इमेजिंग प्लेट को इमेजिंग बॉक्स में नमूना चरण से एक मामूली कोण पर एक्स-रे छवि पर क्षैतिज रूप से ट्रेकिआ को संरेखित करने के लिए संलग्न किया गया था जैसा कि चित्र 2ए में दिखाया गया है।
( ए ) SPring-8 इमेजिंग यूनिट में विवो इमेजिंग सेटअप में, लाल बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित एक्स-रे बीम पथ।(बी, सी) ट्रेकिअल चुंबक स्थानीयकरण दो ऑर्थोगोनली माउंटेड आईपी कैमरों का उपयोग करके दूरस्थ रूप से किया गया था।स्क्रीन पर छवि के बाईं ओर, आप ईटी ट्यूब के अंदर सिर और वितरण प्रवेशनी को पकड़े हुए वायर लूप को देख सकते हैं।
एक रिमोट नियंत्रित सिरिंज पंप सिस्टम (UMP2, वर्ल्ड प्रिसिजन इंस्ट्रूमेंट्स, सारासोटा, FL) 100 μl ग्लास सिरिंज का उपयोग करके 30 Ga सुई का उपयोग करके PE10 ट्यूबिंग (0.61 मिमी OD, 0.28 मिमी ID) से जुड़ा था।ट्यूब को यह सुनिश्चित करने के लिए चिह्नित करें कि अंतःश्वासनली ट्यूब डालते समय टिप श्वासनली में सही स्थिति में है।एक माइक्रोपम्प का उपयोग करके, सिरिंज प्लंजर को हटा दिया गया था और ट्यूब की नोक को वितरित किए जाने वाले एमपी नमूने में डुबो दिया गया था।भरी हुई डिलीवरी ट्यूब को तब एंडोट्रैचियल ट्यूब में डाला गया था, जो टिप को हमारे अपेक्षित लागू चुंबकीय क्षेत्र के सबसे मजबूत हिस्से में रखती है।हमारे Arduino- आधारित टाइमिंग बॉक्स से जुड़े एक सांस डिटेक्टर का उपयोग करके छवि अधिग्रहण को नियंत्रित किया गया था, और सभी संकेतों (जैसे, तापमान, श्वसन, शटर खुला / बंद, और छवि अधिग्रहण) को Powerlab और LabChart (AD Instruments, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। 22 जब इमेजिंग जब हाउसिंग अनुपलब्ध थी, दो आईपी कैमरे (पैनासोनिक BB-SC382) एक दूसरे से लगभग 90 डिग्री पर स्थित थे और इमेजिंग के दौरान श्वासनली के सापेक्ष चुंबक की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता था (चित्र 2b, c)।गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, टर्मिनल श्वसन प्रवाह पठार के दौरान प्रति सांस एक छवि प्राप्त की गई थी।
चुंबक दूसरे चरण से जुड़ा होता है, जो दूर से इमेजिंग बॉडी के बाहर स्थित हो सकता है।चुंबक की विभिन्न स्थितियों और विन्यासों का परीक्षण किया गया, जिनमें शामिल हैं: श्वासनली के ऊपर लगभग 30° के कोण पर रखा गया (विन्यास चित्र 2a और 3a में दिखाए गए हैं);एक चुंबक जानवर के ऊपर और दूसरा नीचे, आकर्षण के लिए सेट किए गए ध्रुवों के साथ (चित्र 3ख)।, जानवर के ऊपर एक चुंबक और नीचे एक, प्रतिकर्षण के लिए निर्धारित ध्रुवों के साथ (चित्र 3सी), और ऊपर एक चुंबक और श्वासनली के लंबवत (चित्र 3डी)।पशु और चुंबक की स्थापना और सिरिंज पंप में परीक्षण के तहत एमपी लोड करने के बाद, छवियों के अधिग्रहण पर 4 μl / सेकंड की दर से 50 μl की एक खुराक वितरित करें।छवियों को प्राप्त करने के लिए जारी रखने के दौरान चुंबक को श्वासनली के साथ या आगे पीछे ले जाया जाता है।
विवो इमेजिंग के लिए चुंबक विन्यास (ए) श्वासनली के ऊपर एक चुंबक लगभग 30 ° के कोण पर, (बी) आकर्षण के लिए कॉन्फ़िगर किए गए दो मैग्नेट, (सी) प्रतिकर्षण के लिए कॉन्फ़िगर किए गए दो मैग्नेट, (डी) एक चुंबक ऊपर और लंबवत श्वासनली।पर्यवेक्षक ने श्वासनली के माध्यम से मुंह से फेफड़ों तक नीचे देखा और एक्स-रे किरण चूहे के बाईं ओर से गुजरी और दाईं ओर से बाहर निकल गई।चुंबक को या तो वायुमार्ग की लंबाई के साथ या एक्स-रे बीम की दिशा में श्वासनली के ऊपर बाएं और दाएं ले जाया जाता है।
हमने श्वसन और हृदय गति के मिश्रण के अभाव में वायुमार्ग में कणों की दृश्यता और व्यवहार को निर्धारित करने की भी मांग की।इसलिए, इमेजिंग अवधि के अंत में, जानवरों को पेंटोबार्बिटल ओवरडोज (सोम्नोपेंटाइल, पिटमैन-मूर, वाशिंगटन क्रॉसिंग, यूएसए; ~ 65 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) के कारण मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी गई।कुछ जानवरों को इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर छोड़ दिया गया था, और सांस लेने और दिल की धड़कन की समाप्ति के बाद, इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराया गया था, एमपी की एक अतिरिक्त खुराक जोड़कर अगर कोई एमपी वायुमार्ग की सतह पर दिखाई नहीं दे रहा था।
परिणामी छवियों को फ्लैट और अंधेरे क्षेत्र के लिए सही किया गया था और फिर MATLAB (R2020a, The Mathworks) में लिखी गई एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करके एक फिल्म (20 फ्रेम प्रति सेकंड; 15–25 × सामान्य गति श्वसन दर के आधार पर) में इकट्ठा की गई थी।
LV जीन वेक्टर डिलीवरी पर सभी अध्ययन यूनिवर्सिटी ऑफ एडिलेड लेबोरेटरी एनिमल रिसर्च सेंटर में आयोजित किए गए थे और इसका उद्देश्य SPring-8 प्रयोग के परिणामों का उपयोग करना था ताकि यह आकलन किया जा सके कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में LV-MP डिलीवरी विवो में जीन ट्रांसफर को बढ़ा सकती है या नहीं। .एमएफ और चुंबकीय क्षेत्र के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, जानवरों के दो समूहों का इलाज किया गया था: एक समूह को एलवी एमएफ के साथ चुंबक प्लेसमेंट के साथ इंजेक्ट किया गया था, और दूसरे समूह को बिना चुंबक के एलवी एमएफ के साथ एक नियंत्रण समूह के साथ इंजेक्ट किया गया था।
एल.वी. जीन वैक्टर पहले वर्णित तरीकों 25, 26 का उपयोग कर उत्पन्न किया गया है।LacZ वेक्टर MPSV संवैधानिक प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारा संचालित एक परमाणु स्थानीयकृत बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ जीन को व्यक्त करता है, जो ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एक नीला प्रतिक्रिया उत्पाद बनाता है, जो मोर्चों पर और फेफड़ों के ऊतकों के वर्गों पर दिखाई देता है।टीयू / एमएल में टिटर की गणना करने के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से लैकज-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या की गणना करके सेल संस्कृतियों में अनुमापन किया गया था।वाहक को -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोसंरक्षित किया जाता है, उपयोग करने से पहले पिघलाया जाता है, और डिलीवरी से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 1: 1 को मिलाकर कॉम्बीमैग से बांध दिया जाता है।
सामान्य Sprague Dawley चूहों (n = 3/group, ~2-3 anesthetized ip 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) और 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) के मिश्रण के साथ 1 महीने की उम्र में) ip ) 16 Ga अंतःशिरा प्रवेशनी के साथ इंजेक्शन और गैर-शल्य मौखिक कैन्युलेशन।यह सुनिश्चित करने के लिए कि श्वासनली वायुमार्ग ऊतक LV पारगमन प्राप्त करता है, यह हमारे पहले वर्णित यांत्रिक गड़बड़ी प्रोटोकॉल का उपयोग करके वातानुकूलित किया गया था जिसमें श्वासनली वायुमार्ग की सतह को तार की टोकरी (एन-सर्कल, नाइटिनोल स्टोन एक्सट्रैक्टर बिना टिप NTSE-022115) -UDH के साथ अक्षीय रूप से रगड़ा गया था। कुक मेडिकल, यूएसए) 30 पृष्ठ28।फिर, जैव सुरक्षा कैबिनेट में गड़बड़ी के लगभग 10 मिनट बाद, LV-MP का श्वासनली प्रशासन किया गया।
इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले चुंबकीय क्षेत्र को विवो एक्स-रे अध्ययन में समान रूप से कॉन्फ़िगर किया गया था, जिसमें आसवन स्टेंट क्लैम्प्स (चित्रा 4) के साथ श्वासनली पर समान चुंबक रखे गए थे।LV-MP का 50 μl वॉल्यूम (2 x 25 μl aliquots) जेल-टिप्ड पिपेट का उपयोग करके श्वासनली (n = 3 जानवरों) तक पहुंचाया गया जैसा कि पहले बताया गया था।नियंत्रण समूह (एन = 3 जानवरों) ने चुंबक के उपयोग के बिना समान एलवी-एमपी प्राप्त किया।जलसेक के पूरा होने के बाद, प्रवेशनी को एंडोट्रैचियल ट्यूब से हटा दिया जाता है और जानवर को बाहर निकाल दिया जाता है।हटाए जाने से पहले 10 मिनट तक चुंबक जगह पर रहता है।चूहों को मेलॉक्सिकैम (1 मिली / किग्रा) (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) के साथ सूक्ष्म रूप से लगाया गया था, इसके बाद 1 मिलीग्राम / किग्रा एटिपामाज़ोल हाइड्रोक्लोराइड (एंटीसेडन, ज़ोइटिस, ऑस्ट्रेलिया) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थीसिया निकासी की गई।एनेस्थीसिया से पूरी तरह से ठीक होने तक चूहों को गर्म रखा गया और देखा गया।
जैविक सुरक्षा कैबिनेट में LV-MP डिलीवरी डिवाइस।आप देख सकते हैं कि ईटी ट्यूब की लाइट ग्रे लुएर-लॉक स्लीव मुंह से बाहर निकलती है, और चित्र में दिखाए गए जेल पिपेट टिप को ईटी ट्यूब के माध्यम से श्वासनली में वांछित गहराई तक डाला जाता है।
LV-MP प्रशासन प्रक्रिया के एक सप्ताह बाद, जानवरों को 100% CO2 के अंतःश्वसन द्वारा मानवीय रूप से बलिदान किया गया और हमारे मानक X-gal उपचार का उपयोग करके LacZ अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया।एंडोट्रैचियल ट्यूब प्लेसमेंट के कारण किसी भी यांत्रिक क्षति या द्रव प्रतिधारण को विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाएगा, यह सुनिश्चित करने के लिए तीन सबसे दुम उपास्थि के छल्ले को हटा दिया गया था।विश्लेषण के लिए दो हिस्सों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक श्वासनली को लंबाई में काटा गया था और ल्यूमिनल सतह की कल्पना करने के लिए एक मिनुटियन सुई (ललित विज्ञान उपकरण) का उपयोग करके सिलिकॉन रबर (सिल्गार्ड, डॉव इंक) युक्त कप में रखा गया था।डिजीलाइट कैमरा और TCapture सॉफ्टवेयर (टक्सन फोटोनिक्स, चीन) के साथ निकॉन माइक्रोस्कोप (SMZ1500) का उपयोग करके ललाट फोटोग्राफी द्वारा ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के वितरण और चरित्र की पुष्टि की गई थी।छवियों को 20x आवर्धन (श्वासनली की पूरी चौड़ाई के लिए अधिकतम सेटिंग सहित) पर प्राप्त किया गया था, श्वासनली की पूरी लंबाई के साथ चरण दर चरण प्रदर्शित किया गया था, प्रत्येक छवि के बीच पर्याप्त ओवरलैप प्रदान करने के लिए छवियों को "सिले" होने की अनुमति दी गई थी।प्रत्येक श्वासनली की छवियों को तब समग्र छवि संपादक संस्करण 2.0.3 (माइक्रोसॉफ्ट रिसर्च) का उपयोग करते हुए प्लानर मोशन एल्गोरिदम का उपयोग करके एक समग्र छवि में जोड़ा गया था। प्रत्येक जानवर से श्वासनली समग्र छवियों के भीतर लैकज अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित28, 0.35 <ह्यू <0.58, संतृप्ति> 0.15, और मान <0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके। प्रत्येक जानवर से श्वासनली समग्र छवियों के भीतर लैकज अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित28, 0.35 <ह्यू <0.58, संतृप्ति> 0.15, और मान <0.7 की सेटिंग्स का उपयोग करके। Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. प्रत्येक जानवर से समग्र ट्रेकिअल छवियों में लैकज अभिव्यक्ति का क्षेत्र एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जैसा कि पहले वर्णित28 में 0.35 की सेटिंग का उपयोग करके किया गया था।0.15 और मान<0 .7।如 前所 ， ， 述 述 matlab （（（（（（2020a ， MathWorks）） 来自 每 只 动物 的 复合 图像 图像 图像 中 中 的 的 的 表达 表达 表达 区域 ， ， ， 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 的如 前所 述 ， 自动 自动 matlab 脚本 （（（（（（2020a ， MathWorks） 来自 每 只 的 气管 图像 的 的 的 的 的 量化 ， ， 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 ， ， ， ， 量化 表达 表达 的 的 的 的 的 的 的 的 的.................... कूल्हा Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . प्रत्येक जानवर के श्वासनली की समग्र छवियों पर लैकज अभिव्यक्ति के क्षेत्रों को एक स्वचालित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले 0.35 <ह्यू <0.58, संतृप्ति> 0.15 और मान <0.7 की सेटिंग का उपयोग करके वर्णित किया गया था।GIMP v2.10.24 में ऊतक आकृति को ट्रैक करके, ऊतक क्षेत्र की पहचान करने और श्वासनली ऊतक के बाहर किसी भी गलत पहचान को रोकने के लिए प्रत्येक समग्र छवि के लिए मैन्युअल रूप से एक मुखौटा बनाया गया था।प्रत्येक जानवर की सभी समग्र छवियों के दाग वाले क्षेत्रों को उस जानवर के लिए कुल दाग वाले क्षेत्र देने के लिए अभिव्यक्त किया गया था।चित्रित क्षेत्र को तब सामान्यीकृत क्षेत्र प्राप्त करने के लिए मुखौटा के कुल क्षेत्र से विभाजित किया गया था।
प्रत्येक श्वासनली पैराफिन में एम्बेडेड थी और 5 माइक्रोन मोटी थी।5 मिनट के लिए न्यूट्रल फास्ट रेड के साथ सेक्शन को काउंटर किया गया और निकॉन एक्लिप्स E400 माइक्रोस्कोप, DS-Fi3 कैमरा और NIS एलिमेंट कैप्चर सॉफ्टवेयर (संस्करण 5.20.00) का उपयोग करके छवियों को हासिल किया गया।
सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म v9 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, इंक।) में किए गए थे।सांख्यिकीय महत्व p ≤ 0.05 पर निर्धारित किया गया था।Shapiro-Wilk परीक्षण का उपयोग करके सामान्यता का परीक्षण किया गया था और एक अप्रकाशित t -est का उपयोग करके LacZ धुंधला में अंतर का मूल्यांकन किया गया था।
तालिका 1 में वर्णित छह एमपी की पीसीएक्सआई द्वारा जांच की गई थी, और दृश्यता तालिका 2 में वर्णित है। दो पॉलीस्टाइन एमपी (एमपी1 और एमपी2; क्रमशः 18 माइक्रोन और 0.25 माइक्रोन) पीसीएक्सआई द्वारा दिखाई नहीं दे रहे थे, लेकिन शेष नमूनों की पहचान की जा सकती थी (उदाहरण चित्र 5 में दिखाए गए हैं)।MP3 और MP4 कमजोर दिखाई दे रहे हैं (10-15% Fe3O4; 0.25 µm और 0.9 µm, क्रमशः)।हालाँकि MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) में परीक्षण किए गए कुछ सबसे छोटे कण थे, यह सबसे अधिक स्पष्ट था।CombiMag MP6 उत्पाद में अंतर करना मुश्किल है।सभी मामलों में, केशिका के समानांतर चुंबक को आगे और पीछे ले जाकर एमएफ का पता लगाने की हमारी क्षमता में काफी सुधार हुआ।जैसे ही चुम्बक केशिका से दूर चले गए, कणों को लंबी श्रृंखलाओं में खींच लिया गया, लेकिन जैसे-जैसे चुम्बक पास आए और चुंबकीय क्षेत्र की ताकत बढ़ती गई, कण श्रृंखलाएँ छोटी होती गईं क्योंकि कण केशिका की ऊपरी सतह की ओर चले गए (पूरक वीडियो S1 देखें) : MP4), सतह पर कण घनत्व में वृद्धि।इसके विपरीत, जब चुंबक को केशिका से हटा दिया जाता है, तो क्षेत्र की ताकत कम हो जाती है और सांसद केशिका की ऊपरी सतह से फैली लंबी श्रृंखलाओं में पुनर्व्यवस्थित होते हैं (पूरक वीडियो S2: MP4 देखें)।चुम्बक के हिलने बंद होने के बाद, कण संतुलन की स्थिति में पहुँचने के बाद कुछ समय तक चलते रहते हैं।जैसे ही एमपी केशिका की ऊपरी सतह की ओर और दूर जाता है, चुंबकीय कण तरल के माध्यम से मलबे को आकर्षित करते हैं।
पीसीएक्सआई के तहत एमपी की दृश्यता नमूनों के बीच काफी भिन्न होती है।(ए) एमपी3, (बी) एमपी4, (सी) एमपी5 और (डी) एमपी6।यहां दिखाए गए सभी चित्र केशिका से लगभग 10 मिमी सीधे ऊपर स्थित चुंबक के साथ लिए गए थे।स्पष्ट बड़े घेरे केशिकाओं में फंसे हवा के बुलबुले हैं, जो स्पष्ट रूप से चरण विपरीत छवि के काले और सफेद किनारे की विशेषताओं को दिखाते हैं।लाल बॉक्स उस आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ध्यान दें कि सभी आंकड़ों में चुंबक सर्किट के व्यास पैमाने पर नहीं हैं और दिखाए गए से लगभग 100 गुना बड़े हैं।
चूंकि चुंबक केशिका के शीर्ष के साथ बाएं और दाएं चलता है, एमपी स्ट्रिंग का कोण चुंबक के साथ संरेखित करने के लिए बदलता है (चित्र 6 देखें), इस प्रकार चुंबकीय क्षेत्र रेखाओं को चित्रित करता है।MP3-5 के लिए, जीवा दहलीज कोण तक पहुँचने के बाद, कण केशिका की ऊपरी सतह के साथ खींचते हैं।इसका परिणाम अक्सर एमपी के बड़े समूहों में होता है जहां चुंबकीय क्षेत्र सबसे मजबूत होता है (पूरक वीडियो S3: MP5 देखें)।यह भी विशेष रूप से स्पष्ट होता है जब केशिका के अंत के करीब इमेजिंग होती है, जो एमपी को तरल-वायु इंटरफ़ेस पर एकत्रित और ध्यान केंद्रित करने का कारण बनती है।MP6 में कण, जो MP3-5 में उन लोगों की तुलना में भेद करना कठिन था, जब चुंबक केशिका के साथ चले गए, तो खींचे नहीं गए, लेकिन MP तार अलग हो गए, कणों को देखने में छोड़ दिया (पूरक वीडियो S4: MP6 देखें)।कुछ मामलों में, जब चुंबक को इमेजिंग साइट से लंबी दूरी पर ले जाकर लागू चुंबकीय क्षेत्र को कम किया गया था, तो कोई भी शेष एमपी धीरे-धीरे गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब की निचली सतह पर उतर गया, शेष स्ट्रिंग में (पूरक वीडियो S5: MP3 देखें) .
एमपी स्ट्रिंग का कोण बदल जाता है क्योंकि चुंबक केशिका के ऊपर दाईं ओर जाता है।(ए) एमपी3, (बी) एमपी4, (सी) एमपी5 और (डी) एमपी6।लाल बॉक्स उस आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।कृपया ध्यान दें कि अतिरिक्त वीडियो सूचनात्मक उद्देश्यों के लिए हैं क्योंकि वे महत्वपूर्ण कण संरचना और गतिशील जानकारी प्रकट करते हैं जिन्हें इन स्थिर छवियों में नहीं देखा जा सकता है।
हमारे परीक्षणों से पता चला है कि श्वासनली के साथ धीरे-धीरे चुंबक को आगे और पीछे ले जाने से विवो में जटिल गति के संदर्भ में एमएफ के दृश्य की सुविधा मिलती है।वीवो परीक्षणों में कोई प्रदर्शन नहीं किया गया क्योंकि केशिका में पॉलीस्टीरिन मोती (एमपी1 और एमपी2) दिखाई नहीं दे रहे थे।शेष चार एमएफ में से प्रत्येक का वीवो में परीक्षण किया गया था जिसमें श्वासनली के ऊपर लगभग 30 ° के कोण पर ऊर्ध्वाधर (आंकड़े 2 बी और 3 ए देखें) के कोण पर स्थित चुंबक की लंबी धुरी के साथ, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप लंबी एमएफ श्रृंखलाएं थीं और अधिक प्रभावी थीं। एक चुंबक की तुलना में।.विन्यास समाप्त।MP3, MP4 और MP6 किसी भी जीवित जानवर की श्वासनली में नहीं पाए गए हैं।जानवरों को मानवीय रूप से मारने के बाद चूहों के श्वसन पथ की कल्पना करते समय, सिरिंज पंप का उपयोग करके अतिरिक्त मात्रा जोड़ने पर भी कण अदृश्य रहे।MP5 में सबसे अधिक आयरन ऑक्साइड सामग्री थी और यह एकमात्र दृश्यमान कण था, इसलिए इसका उपयोग विवो में MP के व्यवहार का मूल्यांकन और विशेषता करने के लिए किया गया था।
एमएफ सम्मिलन के दौरान श्वासनली पर चुंबक की नियुक्ति के परिणामस्वरूप कई, लेकिन सभी नहीं, एमएफ देखने के क्षेत्र में केंद्रित हो रहे हैं।मानव रूप से इच्छामृत्यु वाले जानवरों में कणों का श्वासनली प्रवेश सबसे अच्छा देखा जाता है।चित्र 7 और पूरक वीडियो S6: MP5 वेंट्रल ट्रेकिआ की सतह पर तेजी से चुंबकीय कैप्चर और कणों के संरेखण को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि सांसदों को ट्रेकिआ के वांछित क्षेत्रों में लक्षित किया जा सकता है।एमएफ डिलीवरी के बाद श्वासनली के साथ अधिक दूर से खोज करने पर, कुछ एमएफ कैरिना के करीब पाए गए, जो सभी एमएफ को इकट्ठा करने और धारण करने के लिए अपर्याप्त चुंबकीय क्षेत्र की ताकत का संकेत देता है, क्योंकि वे द्रव प्रशासन के दौरान अधिकतम चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के क्षेत्र के माध्यम से वितरित किए गए थे।प्रक्रिया।हालांकि, प्रसवोत्तर एमपी सांद्रता छवि क्षेत्र के आसपास अधिक थी, यह सुझाव देते हुए कि कई सांसद वायुमार्ग क्षेत्रों में बने रहे जहां लागू चुंबकीय क्षेत्र की ताकत सबसे अधिक थी।
इमेजिंग क्षेत्र के ठीक ऊपर एक चुंबक के साथ हाल ही में इच्छामृत्यु वाले चूहे के श्वासनली में MP5 की डिलीवरी के बाद (ए) से पहले और (बी) की छवियां।दर्शाया गया क्षेत्र दो उपास्थि के छल्ले के बीच स्थित है।एमपी डिलीवर होने से पहले वायुमार्ग में कुछ तरल पदार्थ होता है।लाल बॉक्स उस आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ये चित्र S6: MP5 पूरक वीडियो में दिखाए गए वीडियो से लिए गए हैं।
विवो में श्वासनली के साथ चुंबक को ले जाने से वायुमार्ग की सतह पर एमपी श्रृंखला के कोण में परिवर्तन हुआ, जैसा कि केशिकाओं में देखा गया है (चित्र 8 और पूरक वीडियो S7: MP5 देखें)।हालाँकि, हमारे अध्ययन में, सांसदों को जीवित श्वसन पथ की सतह के साथ नहीं खींचा जा सकता था, जैसा कि केशिकाएँ कर सकती थीं।कुछ मामलों में, एमपी श्रृंखला लंबी हो जाती है क्योंकि चुंबक बाएं और दाएं चलता है।दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी पाया कि कण श्रृंखला द्रव की सतह परत की गहराई को बदल देती है जब चुंबक को श्वासनली के साथ अनुदैर्ध्य रूप से ले जाया जाता है, और जब चुंबक को सीधे ऊपर की ओर ले जाया जाता है और कण श्रृंखला को एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में घुमाया जाता है (देखें) पूरक वीडियो S7)।: MP5 0:09 पर, नीचे दाएं)।विशेषता आंदोलन पैटर्न बदल गया जब चुंबक को बाद में ट्रेकेआ के शीर्ष पर ले जाया गया (यानी, ट्रेकेआ की लंबाई के बजाय जानवर के बाएं या दाएं)।उनके आंदोलन के दौरान कण अभी भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, लेकिन जब श्वासनली से चुंबक को हटा दिया गया, तो कण तारों की युक्तियां दिखाई देने लगीं (पूरक वीडियो S8 देखें: MP5, 0:08 से शुरू)।यह एक ग्लास केशिका में लागू चुंबकीय क्षेत्र की कार्रवाई के तहत चुंबकीय क्षेत्र के देखे गए व्यवहार से सहमत है।
एक जीवित एनेस्थेटाइज़्ड चूहे के श्वासनली में MP5 दिखाते हुए नमूना चित्र।(ए) चुंबक का उपयोग श्वासनली के ऊपर और बाईं ओर छवियों को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, फिर (बी) चुंबक को दाईं ओर ले जाने के बाद।लाल बॉक्स उस आवर्धन को इंगित करता है जो कंट्रास्ट को बढ़ाता है।ये चित्र S7 के पूरक वीडियो: MP5 में दिखाए गए वीडियो से हैं।
जब दो ध्रुवों को श्वासनली के ऊपर और नीचे एक उत्तर-दक्षिण अभिविन्यास में ट्यून किया गया था (यानी, आकर्षित करना; अंजीर। 3 बी), एमपी कॉर्ड लंबे समय तक दिखाई दिए और श्वासनली की पृष्ठीय सतह के बजाय श्वासनली की पार्श्व दीवार पर स्थित थे। श्वासनली (परिशिष्ट देखें)।वीडियो S9:MP5).हालांकि, एक साइट पर कणों की उच्च सांद्रता (यानी, श्वासनली की पृष्ठीय सतह) एक दोहरी चुंबक डिवाइस का उपयोग करके द्रव प्रशासन के बाद नहीं पाई गई, जो आमतौर पर एक चुंबक डिवाइस के साथ होती है।फिर, जब एक चुंबक को विपरीत ध्रुवों (चित्र 3सी) को पीछे हटाने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था, तो डिलीवरी के बाद देखने के क्षेत्र में दिखाई देने वाले कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।उच्च चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के कारण दोनों दो चुंबक विन्यासों को स्थापित करना चुनौतीपूर्ण है जो क्रमशः चुंबकों को आकर्षित या धक्का देता है।तब सेटअप को वायुमार्ग के समानांतर एक एकल चुंबक में बदल दिया गया था लेकिन वायुमार्ग से 90 डिग्री के कोण पर गुजर रहा था ताकि बल की रेखाएं श्वासनली की दीवार को ओर्थोगोनली (चित्रा 3डी) से पार कर सकें, एक अभिविन्यास जिसका उद्देश्य कण एकत्रीकरण की संभावना को निर्धारित करना है पार्श्व दीवार।परीक्षण में रहना।हालांकि, इस विन्यास में, कोई पहचानने योग्य एमएफ संचय आंदोलन या चुंबक आंदोलन नहीं था।इन सभी परिणामों के आधार पर, जीन कैरियर्स (अंजीर। 3 ए) के विवो अध्ययन के लिए एकल चुंबक और 30-डिग्री अभिविन्यास के साथ एक कॉन्फ़िगरेशन चुना गया था।
जब जानवर को मानवीय रूप से बलिदान किए जाने के तुरंत बाद कई बार चित्रित किया गया था, तो हस्तक्षेप करने वाले ऊतक गति की अनुपस्थिति का मतलब था कि चुंबक के अनुवाद संबंधी गति के अनुसार स्पष्ट इंटरकार्टिलाजिनस क्षेत्र में महीन, छोटी कण रेखाओं को देखा जा सकता है।MP6 कणों की उपस्थिति और गति को स्पष्ट रूप से देखें।
LV-LacZ का टिटर 1.8 x 108 IU/mL था, और CombiMag MP (MP6) के साथ 1:1 को मिलाने के बाद, जानवरों को LV वाहन के 9 x 107 IU/ml की ट्रेकिअल खुराक के 50 μl के साथ इंजेक्ट किया गया (यानी 4.5 x 106 टीयू/रैट)।).).इन अध्ययनों में, श्रम के दौरान चुंबक को स्थानांतरित करने के बजाय, हमने यह निर्धारित करने के लिए चुंबक को एक स्थिति में तय किया कि क्या एलवी ट्रांसडक्शन (ए) चुंबकीय क्षेत्र की अनुपस्थिति में वेक्टर डिलीवरी की तुलना में बेहतर हो सकता है, और (बी) यदि वायुमार्ग हो सकता है ध्यान केंद्रित किया।कोशिकाओं को ऊपरी श्वसन पथ के चुंबकीय लक्ष्य क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जा रहा है।
एलवी वैक्टर के साथ संयोजन में मैग्नेट की उपस्थिति और कॉम्बीमैग का उपयोग पशु स्वास्थ्य पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालता है, जैसा कि हमारे मानक एलवी वेक्टर डिलीवरी प्रोटोकॉल ने किया था।यांत्रिक गड़बड़ी (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1) के अधीन श्वासनली क्षेत्र की ललाट छवियों से पता चला है कि एलवी-एमपी उपचारित समूह में चुंबक (चित्र। 9 ए) की उपस्थिति में पारगमन का उच्च स्तर था।नियंत्रण समूह (चित्रा 9 बी) में केवल थोड़ी मात्रा में नीला लैकज़ धुंधला मौजूद था।एक्स-गैल-सना हुआ सामान्यीकृत क्षेत्रों की मात्रा का पता चला है कि चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में एलवी-एमपी के प्रशासन के परिणामस्वरूप लगभग 6 गुना सुधार हुआ है (चित्र 9सी)।
एलवी-एमपी (ए) के साथ चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में और (बी) चुंबक की अनुपस्थिति में ट्रेकिअल ट्रांसडक्शन दिखाने वाली समग्र छवियों का उदाहरण।(c) एक चुंबक (*p = 0.029, t-test, n = 3 प्रति समूह, मतलब ± माध्य की मानक त्रुटि) के उपयोग के साथ श्वासनली में LacZ पारगमन के सामान्यीकृत क्षेत्र में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सुधार।
तटस्थ तेजी से लाल-दाग वाले खंड (पूरक चित्र 2 में दिखाए गए उदाहरण) ने संकेत दिया कि लैकज-सना हुआ कोशिकाएं एक ही नमूने में और उसी स्थान पर मौजूद थीं जैसा कि पहले बताया गया था।
वायुमार्ग जीन थेरेपी में प्रमुख चुनौती रुचि के क्षेत्रों में वाहक कणों का सटीक स्थानीयकरण और वायु प्रवाह और सक्रिय बलगम निकासी की उपस्थिति में मोबाइल फेफड़े में उच्च स्तर की पारगमन क्षमता की उपलब्धि है।सिस्टिक फाइब्रोसिस में श्वसन रोगों के उपचार के लिए लक्षित एलवी वाहकों के लिए, प्रवाहकीय वायुमार्गों में वाहक कणों के निवास समय को बढ़ाना अब तक एक अप्राप्य लक्ष्य रहा है।जैसा कि कैस्टेलानी एट अल द्वारा इंगित किया गया है, पारगमन को बढ़ाने के लिए चुंबकीय क्षेत्रों के उपयोग से अन्य जीन वितरण विधियों जैसे इलेक्ट्रोपोरेशन पर लाभ होता है क्योंकि यह सादगी, अर्थव्यवस्था, स्थानीय वितरण, बढ़ी हुई दक्षता और कम ऊष्मायन समय को जोड़ सकता है।और संभवतः वाहन10 की कम खुराक।हालांकि, बाहरी चुंबकीय बलों के प्रभाव में वायुमार्ग में चुंबकीय कणों के विवो जमाव और व्यवहार में कभी भी वर्णित नहीं किया गया है, और वास्तव में जीवित रहने वाले वायुमार्गों में जीन अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाने के लिए इस पद्धति की क्षमता विवो में प्रदर्शित नहीं की गई है।
पीसीएक्सआई सिंक्रोट्रॉन पर हमारे इन विट्रो प्रयोगों से पता चला है कि एमपी पॉलीस्टाइनिन के अपवाद के साथ हमारे द्वारा परीक्षण किए गए सभी कण हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग सेटअप में दिखाई दे रहे थे।एक चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में, चुंबकीय क्षेत्र तार बनाते हैं, जिसकी लंबाई कणों के प्रकार और चुंबकीय क्षेत्र की ताकत (यानी, चुंबक की निकटता और गति) से संबंधित होती है।जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है, हम जो तार देखते हैं, वे बनते हैं क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगत कण चुम्बकित हो जाता है और अपने स्वयं के स्थानीय चुंबकीय क्षेत्र को प्रेरित करता है।ये अलग-अलग क्षेत्र अन्य कणों के आकर्षण और प्रतिकर्षण के स्थानीय बलों से स्थानीय बलों के कारण समूह स्ट्रिंग गति के साथ अन्य समान कणों को इकट्ठा करने और कनेक्ट करने का कारण बनते हैं।
आरेख दिखा रहा है (ए, बी) द्रव से भरे केशिकाओं के अंदर बनने वाले कणों की श्रृंखला और (सी, डी) एक हवा से भरे ट्रेकिआ।ध्यान दें कि केशिकाएं और श्वासनली पैमाने पर नहीं खींची जाती हैं।पैनल (ए) में जंजीरों में व्यवस्थित Fe3O4 कणों वाले एमएफ का विवरण भी शामिल है।
जब चुंबक केशिका के ऊपर चला गया, तो कण स्ट्रिंग का कोण Fe3O4 वाले MP3-5 के लिए महत्वपूर्ण सीमा तक पहुंच गया, जिसके बाद कण स्ट्रिंग अब अपनी मूल स्थिति में नहीं रही, बल्कि सतह के साथ एक नई स्थिति में चली गई।चुंबक।यह प्रभाव होने की संभावना होती है क्योंकि कांच केशिका की सतह इस गति को होने देने के लिए पर्याप्त चिकनी होती है।दिलचस्प बात यह है कि MP6 (कॉम्बीमैग) ने इस तरह से व्यवहार नहीं किया, शायद इसलिए कि कण छोटे थे, एक अलग कोटिंग या सतह चार्ज था, या मालिकाना वाहक तरल पदार्थ ने स्थानांतरित करने की उनकी क्षमता को प्रभावित किया।कॉम्बीमैग कण छवि में कंट्रास्ट भी कमजोर है, यह सुझाव देता है कि तरल और कणों का घनत्व समान हो सकता है और इसलिए आसानी से एक दूसरे की ओर नहीं बढ़ सकते हैं।यदि चुंबक बहुत तेजी से चलता है तो कण भी फंस सकते हैं, यह दर्शाता है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत हमेशा द्रव में कणों के बीच घर्षण को दूर नहीं कर सकती है, यह सुझाव देता है कि चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और चुंबक और लक्ष्य क्षेत्र के बीच की दूरी एक के रूप में नहीं आनी चाहिए आश्चर्य।महत्वपूर्ण।इन परिणामों से यह भी संकेत मिलता है कि हालांकि चुंबक लक्ष्य क्षेत्र के माध्यम से बहने वाले कई माइक्रोपार्टिकल्स को पकड़ सकते हैं, लेकिन यह संभावना नहीं है कि ट्रेकिआ की सतह के साथ कॉम्बीमैग कणों को स्थानांतरित करने के लिए मैग्नेट पर भरोसा किया जा सकता है।इस प्रकार, हमने निष्कर्ष निकाला कि विवो एलवी एमएफ अध्ययनों में वायुमार्ग के पेड़ के विशिष्ट क्षेत्रों को भौतिक रूप से लक्षित करने के लिए स्थिर चुंबकीय क्षेत्रों का उपयोग करना चाहिए।
एक बार कणों को शरीर में पहुंचा दिए जाने के बाद, उन्हें शरीर के जटिल गतिमान ऊतक के संदर्भ में पहचानना मुश्किल होता है, लेकिन एमपी स्ट्रिंग्स को "विगल" करने के लिए श्वासनली के ऊपर चुंबक को क्षैतिज रूप से घुमाकर उनकी पहचान क्षमता में सुधार किया गया है।जबकि रीयल-टाइम इमेजिंग संभव है, जानवर को मानवीय रूप से मारे जाने के बाद कण की गति को समझना आसान है।इस स्थान पर एमपी सांद्रता आमतौर पर उच्चतम थी जब चुंबक इमेजिंग क्षेत्र पर स्थित था, हालांकि कुछ कण आमतौर पर श्वासनली के नीचे पाए जाते थे।इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, कणों को चुंबक की गति से श्वासनली में नीचे नहीं खींचा जा सकता है।यह खोज इस बात के अनुरूप है कि श्वासनली की सतह को ढंकने वाला बलगम आमतौर पर साँस के कणों को कैसे संसाधित करता है, उन्हें बलगम में फँसाता है और बाद में उन्हें म्यूको-सिलिअरी क्लीयरेंस तंत्र के माध्यम से साफ़ करता है।
हमने अनुमान लगाया कि आकर्षण के लिए श्वासनली के ऊपर और नीचे चुम्बकों का उपयोग (चित्र 3 बी) एक चुंबकीय क्षेत्र के बजाय अधिक समान चुंबकीय क्षेत्र में हो सकता है, जो एक बिंदु पर अत्यधिक केंद्रित होता है, जिसके परिणामस्वरूप कणों का अधिक समान वितरण होता है।.हालाँकि, हमारे प्रारंभिक अध्ययन में इस परिकल्पना का समर्थन करने के लिए स्पष्ट प्रमाण नहीं मिले।इसी तरह, चुम्बकों की एक जोड़ी को खदेड़ने के लिए (चित्र 3c) सेट करने से छवि क्षेत्र में अधिक कण बसने का परिणाम नहीं हुआ।इन दो निष्कर्षों से पता चलता है कि दोहरी-चुंबक सेटअप एमपी पॉइंटिंग के स्थानीय नियंत्रण में उल्लेखनीय रूप से सुधार नहीं करता है, और परिणामी मजबूत चुंबकीय बलों को ट्यून करना मुश्किल होता है, जिससे यह दृष्टिकोण कम व्यावहारिक हो जाता है।इसी तरह, ट्रेकिआ (चित्रा 3डी) के ऊपर और उसके पार चुंबक को उन्मुख करने से भी छवि वाले क्षेत्र में शेष कणों की संख्या में वृद्धि नहीं हुई।इनमें से कुछ वैकल्पिक विन्यास सफल नहीं हो सकते हैं क्योंकि वे निक्षेपण क्षेत्र में चुंबकीय क्षेत्र की ताकत में कमी लाते हैं।इस प्रकार, 30 डिग्री (चित्र 3ए) पर एकल चुंबक विन्यास को विवो परीक्षण विधि में सबसे सरल और सबसे कुशल माना जाता है।
एलवी-एमपी अध्ययन से पता चला है कि जब एलवी वैक्टर को कॉम्बीमैग के साथ जोड़ा गया था और एक चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति में शारीरिक रूप से परेशान होने के बाद वितरित किया गया था, नियंत्रण की तुलना में श्वासनली में पारगमन का स्तर काफी बढ़ गया था।सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अध्ययन और लैकजेड परिणामों के आधार पर, चुंबकीय क्षेत्र एलवी को श्वासनली में रखने और वेक्टर कणों की संख्या को कम करने में सक्षम दिखाई दिया जो तुरंत फेफड़ों में गहराई तक प्रवेश कर गए।इस तरह के लक्ष्यीकरण सुधारों से वितरित टाइटर्स, गैर-लक्षित ट्रांसडक्शन, भड़काऊ और प्रतिरक्षा दुष्प्रभाव और जीन स्थानांतरण लागत को कम करते हुए उच्च दक्षता प्राप्त हो सकती है।महत्वपूर्ण रूप से, निर्माता के अनुसार, CombiMag का उपयोग अन्य वायरल वैक्टर (जैसे AAV) और न्यूक्लिक एसिड सहित अन्य जीन स्थानांतरण विधियों के संयोजन में किया जा सकता है।